Опубликована первая онлайн: 19 ноября 2007 года. DOI: 10.1136/gut.2007.125419
Гут 2008;57:483-491
Copyright © 2008 BMJ Publishing Group Ltd & Британского общества гастроэнтерологов.
Рак поджелудочной железы
Сахарный регрессия рака intratumoural инъекций жить Streptococcus pyogenes В сингенных модель мыши
С Maletzki1, М Linnebacher2, B Kreikemeyer3, J Emmrich1

1 Отделение гастроэнтерологии, Отдел внутренней медицины, Университет Ростока, Росток, Германия
2 Кафедрой общей, торакальной, сосудистой хирургии и трансплантологии, Университет Ростока, Росток, Германия
3 Отдел медицинской микробиологии и гигиены больница, Институт медицинской микробиологии, вирусологии и гигиены, Университет Ростока, Росток, Германия

С Maletzki, Отделение гастроэнтерологии, Отдел внутренней медицины, Университет Ростока, Эрнст-Heydemann-Str. 6, D-18055 Rostock, Germany; Claudia.Maletzki @ Uni-rostock.de


Пересмотренный вариант получил 28 сентября 2007
Принято 6 ноября 2007



АННОТАЦИЯ
TOP
АННОТАЦИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ
ОБСУЖДЕНИЕ
Ссылки


Справочная информация: Это исследование имя потенциал бактериолитический терапия использование Streptococcus pyogenes В сингенных рака поджелудочной железы мышиной моделью.

Методы: Panc02 опухоли либо были инфицированы S pyogenes или были относиться с эквивалентный объем транспортного средства. В дополнение к оценка гистологии опухоли и иммуногистохимии, изолированных спленоцитов были проанализированы с помощью проточной цитометрии. Интерферон (IFN) секреции как реакция спленоцитов против опухолевых клеток Было показано, через технику ELISPOT. Цитотоксического эффекта лимфоцитов с целью опухоль была обнаружена лактат (ЛДГ) освобождение. Были измерены уровни цитокинов в сыворотке крови.

Результаты: Однократного применения живых бактерий в штатные Panc02 Опухоли привели в полной регрессии опухоли. Это antitumoural Эффект сопровождался массовым лейкоцитов проникновения опухолей, а также значительный и устойчивый высота системного уровня провоспалительных цитокинов IFN, Опухоль фактор некроза и интерлейкина 6. Лимфоцитов получены от мышей специально признаются сингенных клеток опухоли В IFN-ELISPOT и, самое главное в клеточной цитотоксичности проб, что свидетельствует об опухоли-специфического иммунного ответа.

Выводы: Мы предоставляем данные, как прямые, так литической активности S pyogenes опухолевых клеток к инфекции и механических инфильтрация опухоли клетками иммунной системе приводят к ущербу опухолевых клеток после распространения опухоли компоненты. Последний результат позволяет активации опухоли конкретного опухолевых клеток, вероятно, в осушение лимфатические узлы, способствовали По провоспалительных контексте. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о что применение жить S pyogenes может быть перспективным новым стратегия лечения для продвинутых больных раком поджелудочной железы, что требует дальнейшего расследования.


Цель иммунотерапии является стимуляция иммунной Система восстановить свою способность распознавать и реагировать на остаточную опухолевые клетки, и это может быть полезным дополнением к обычным противоопухолевой стратегии.1 Иммунотерапия началась более 100 лет назад Нью-Йорк, когда хирург Уильям B Коули отметил, что злокачественные опухолей, особенно саркомы, регрессировал у пациентов, которые развитые одновременных бактериальная инфекция после хирургической резекции.2 Таким образом, Прививка токсин Коули's, бактериальная вакцина из Streptococcus pyogenes и Serratia marcescens, Стала Краеугольным камнем в развитии иммунотерапии онкологических заболеваний. Пациенты, кто пережил болезнь инфекционные процессы, в том числе высокая температура и озноб, а также испытали благотворное влияние по злокачественности и, наконец, вылечить их опухолей развитие мощного иммунного ответа.2

Основываясь на этой первоначальной работы исследователи разработали много различные формы иммунотерапии, включая передачу иммунных клеток активных например, лимфокин-активированных клетки-убийцы, применение моноклональных антител (МоАТ), активация специфических клеток эффекторных опухолью лизатами клетка или выдержки, а также активизация неспецифических эффекторных клеток (макрофагов, естественных киллеров (NK) клеток) микробных или химических адъюванты.1 Интересно, что закапывание жизнеспособной ослабленный микобактерии БЦЖ-конкретно-прежнему успешной используемые в клинических лечении поверхностного рака мочевого пузыря.3 Сегодня, Хорошо известно, что как прямое tumouricidal эффекты и активации иммунной системы посредников эти противоопухолевые деятельности бактерии или их компонентов.4--6 В последнее время несколько групп разработали новые подходы с использованием antitumoural опухоль-терапевтический бактериальных штаммов. Yazawa и др. описывали селективному Потенциал роста анаэробных Bifidobacterium Longum в гипоксической регионов несколько видов твердых опухолей.7 8 Аналогичным образом, Фогельштейн и сотрудники разработали эффективную antitumoural терапию, сочетая внутривенного введения смертоносного токсин свободно споры Clostridium новый со стандартной химиотерапией.9 10 Совсем недавно, Чжао и др. создал ослабленный штамм Сальмонелла Typhimurium которые избирательно растет и убивает простаты опухолевых клеток в обнаженная модель мыши.11

Учитывая мрачные прогнозы для больных с протоковой аденокарциномы поджелудочной железы,1 12 Роман иммунотерапевтическим возможностей вмешательства Должны быть разработаны для лечения этого злокачественности.4 13--16 Streptococcus pyogenes является важным факультативно анаэробных патогенов, что может вызывать инфекции различной степени тяжести в организме человека, начиная от простых, не гнойных инфекций глотки и кожи опасные для жизни инвазивными инфекциями.17 В настоящем исследовании, Мы стремились к решению вопроса о том, бактериолитический терапия использование S pyogenes применяется для лечения рака поджелудочной железы. К достижения этой цели, мы проанализировали воздействие одного intratumoural инъекция S pyogenes на установленных мышиных опухолей поджелудочной железы В сингенных модель мыши. Это одно применение S pyogenes привели к полной регрессии опухоли в течение 4 недель. Массовый активизация иммунных механизмов реагирования вторичными по отношению к инфекции сопровождал регрессии и способствовали искоренению опухолей.

Таким образом, S pyogenes может быть отличным кандидатом на оценка активной противоопухолевой терапии. Эти выводы могут иметь специальный медицинский интерес для аддитивных лечения больных при опухолях поджелудочной железы.




МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
TOP
АННОТАЦИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ
ОБСУЖДЕНИЕ
Ссылки


Клеточные линии и мышей
Panc02 клеток (любезно предоставлены д-р Арно Шольц, Шарите-Университет Медицина Берлин, Берлин, Германия) были первоначально созданы По Корбетт и его сотрудниками в 1984 году 3-МЕТИЛХОЛАНТРЕНОМ лечение из pancreata женщин C57Bl / 6 мышей.18 EL4 клеток лимфомы и ректальной полиплоидных клетки карциномы CMT-93 были представлены American Type Culture Collection (Манассас, VA). Фибробластоподобных MC3T3-E1 клетки были приобретены у Deutsche Sammlung фон Mikroorganismen Und Zellkulturen (Брауншвейг, Германия). Все клеток были сохранены в измененных Eagle's Дульбекко's средой (DMEM; Биочром AG, Берлин, Германия), дополненные 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ПАК, Кельбе, Германия) и 1% пенициллином / стрептомицином (Инвитроген, Карлсруэ, Германия), и инкубировали при 37 ° C в увлажненной атмосфере 5% CO2. Женские 8-10-недельного возраста C57Bl/6N мышами было приобретено от Charles River вкл. (Sulzfeld, Германия). Животные подвергались воздействию циклы light/12 ч 12 ч тьмы и получили стандартный продовольствием и водой неограниченное объявлений. На утверждение местного комитета защиты животных, эксперименты были проведены в соответствии с немецким законодательством о охраны животных и "Руководство по уходу и использованию Лабораторных животных ".


Бактериальный штамм, условия и культура
Одну группу стрептококковой изолировать, S pyogenes серотип М49 (штамм 591), культивируют в Тодда-Хьюитт (TH) бульон или TH на агар (Oxoid Unipath, Везель, Германия), и дополнен с 0,5% дрожжевого экстракта (THY), была использована в данном исследовании. Для intratumoural инфекции, S pyogenes был выращен в бульоне TH ночь до середины журнала фазе и доводили до концентрации, равной примерно 1X106 Колония-единиц (КОЕ) / мл на основе оптической плотности Рединг при 600 нм и на обшивке анализа.


Животный опухоль модели и применение бактериальных
Краткое под наркозом эфира, женщины вводили мышам C57Bl/6N подкожно в заднюю правую фланге с 1X106 Panc02 клеток. Объем перерастает опухолей были оценены в соответствии с следующей формуле: ширина2XдлинаX0.52.9 При опухолях достигнута размером приблизительно 60 мм3, Около 9-12 дней после опухоль Сотовый прививки, одна группа была заражена с intratumourally 1X106 КОЕ / мл S pyogenes (50 мкл том, растворенных в фосфатно-буферном физиологический раствор (PBS), N = 28). Животные, которые получили эквивалентные объемы растворителя один служил в качестве транспортного средства обращению управления (транспортное средство, N = 6). Группа без intratumoural инъекций служила Опухоль несущих контроля (опухоли, N = 6). Дополнительные группы опухолей, свободных животные обрабатывали 1X106 КОЕ / мл S pyogenes внутрикожно в правую заднюю фланга (М49-C, N = 6). Физиологические контроль значения были получены от животных без какого-либо вмешательства (контроль, N = 3). Мышей пожертвовала 7, 14, 21 и 28 дней После бактериальной инфекции или когда они стали перед умирающим Опухоль объем достиг 1500 мм3. В конце каждого эксперимента образцы крови, опухоли, селезенку и лимфатические узлы брыжейки были удалены от животных всех групп для дальнейшего анализа. Чтобы оценить частоту системной распространения S pyogenes, образцы крови у всех зараженных животных были приняты в данном моментов времени (день 7, 14, 21 и 28) и покрыт кровью на овцах агара.


Rechallenge эксперимент
Через четыре недели после иммунотерапии S pyogenes, Успешно лечение и М49-С животными (каждый N = 6), полученные tumourigenic Доза Panc02 опухолевые клетки (1X106) Во фланг, контралатеральной на первой стороне применения опухоли. Были измерены объемы Опухоль два раза в неделю, как описано выше, за 4 недели до животными Были euthanised.


Апоптоз анализа
Для обнаружения апоптоз, клетки и впоследствии trypsinised лизированной. Количественной оценки активности каспазы 3, Б. Д. ApoAlert Каспазы пробирного пластинка была использована в соответствии с заводом-изготовителем Инструкции (BD Biosciences, Гейдельберг, Германия). Каспазы 3 активность определяли флуорометрического обнаружения на Cytofluor 2300 (Millipore, Schwalbach, Германия, EX / EM: 380/460 нм).19 Кроме того, апоптоз была количественно с помощью проточной цитометрии суб-G1 Пик анализ, как описано ранее.20


Гистологии и иммуногистохимия
Лейкоциты в резекции опухоли тканей, окрашенных по CAE (хлорацетат эстераза) техники. Количества лейкоцитов / мм2 были определены в ослепила рассчитывает положительной окраски и морфологии В 50 последовательных полях высокой мощности (HPFS). Для подтверждения лейкоцитов инфильтрации опухоли в массе, срезов тканей инкубировали с анти-коза мыши CD4 (1:100, Санта-Крус биотехнологии, Гейдельберг, Германия), крысы против мыши CD8 (1:200, Санта-Крус Биотехнологии), и Кролик, анти-CD88 мыши (1:200, Санта-Крус) антител в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем щелочной фосфатазы, конъюгированных антителами мыши (Санта-Крус). Сайты из обязательных фосфатазы определяли, используя фуксин как хромоген. Counterstained срезов гематоксилин и изучила с помощью световой микроскопии (Axioskop 40, Zeiss, Оберкохен, Германия).


Проточная цитометрия
СПЛЕНОЦИТАХ были выделены в различные моменты времени с инфицированными и не инфицированные животные помощью Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, Упсала, Швеция) Градиент центрифугирования. Впоследствии клетки были названы следующие изотиоцианата флуоресцеина (FITC) конъюгированных крысы против мыши МКАТ: CD4, CD8, CD11b, Gr1, CD62L (1:20, Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия), CD25 и CD71 (1:20, Б. Pharmingen). Образцы анализировались на FACSCalibur Цитометра (BD Pharmingen) с помощью программного обеспечения CellQuest.


ELISPOT тест на интерферон -секретирующие лимфоциты
Интерферон (IFN)-конкретный МАБ (Mabtech, Гамбург, Германия) с покрытием, 96-а microtitre пластины были наполнены 1X104 цель клеток / а (Panc02, EL4, CMT-93, MC3T3-E1 и периферической крови мононуклеарных клеток (PBMCs)) и инкубировали в течение 2 ч. СПЛЕНОЦИТАХ (105) Была предоставлена на цели и совместное культурное одночасье. Наконец, антитело были визуализированы на 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат / Nitro Blue тетразолия (BCIP / НБТ; KPL, Gaithersburg, MD), и пятна насчитывалось помощью вскрытия микроскоп (Zeiss, Оберкохен, Германия). Представлены номера ИФНсекретирующих клеток на 105 эффекторных клеток с поправкой на фоновый уровень учитываются в отсутствие клетки-мишени, которая обычно составляет от 10 и 20 spots/105 клеток. Клетки-мишени без эффекторных клеток показали не фонового уровня.


Лактатдегидрогеназа цитотоксический
Колориметрический CytoTox одной однородной мембраны Integrity Assay (Promega, Мэдисон, Висконсин) был использован оценке лактатдегидрогеназы (ЛДГ) освобождение от лизис клеток. Были проведены эксперименты по к протоколу производителя. Литической активности лимфоцитов от брыжеечных лимфатических узлов против клеток-мишеней (Panc02, EL4, CMT-93, MC3T3-E1 и PBMCs) была измерена ночь после инкубации на Effector: клетки-мишени отношением 30:1. Максимальный ЛДГ релиз была достигнута при инкубации клеток-мишеней с помощью прилагаемого лизис буфера. Были использованы клетки-мишени без эффекторных клеток как негативный контроль. Флуоресценции, измеренных на Cytofluor 2300 (Millipore, EX / EM: 530/620 нм). Был рассчитан Цитотоксичность по следующей формуле:% = 100 цитотоксичностьX (экспериментальное релиз - спонтанное освобождение эффекторных клеток -- спонтанный релиз клеток-мишеней) / (максимальный ЛДГ релиз -- спонтанный релиз (негативный контроль) клеток-мишеней).21 22


Bio-Plex Белки Array система
Группа цитокинов сыворотки крови измерялся в двух экземплярах помощью Bio-Plex Белки Array системы (BioRad, Мюнхен, Германия), согласно с инструкциями производителя. С Bio-Plex цитокинов комплекта анализа в сочетании с Bio-Plex Manager Программное обеспечение, сывороточного ИФН, Фактор некроза опухоли (ФНО), Интерлейкин (IL) 3, IL5, IL6, гранулоциты-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и колоний гранулоцитов стимулирующего фактора (Г-КСФ) оцениваются на протяжении всего времени ходе инфекции. Значения соответствующего уровня сывороточных цитокинов в контрольной группе Мышей набор 1, а все остальные данные, переданные в виде X раза увеличивать.


Статистика
Все значения выражаются в виде среднего (SEM). Поскольку ни одно значительное Разница была измерена в любой из оценки параметров между транспортного средства-животных и лечение опухолей-переноски и М49-инфицированных Опухоль свободных мыши в различные моменты времени, данные только из одного момент времени (день 28, N = 6) были приняты для графического представления и статистическая оценка. Данные из необработанных контрольных животных (N = 3) служит физиологической ценности и отображаются в графики, однако они не были рассмотрены на статистических анализ между группами. Аналогичным образом, опухоль, свободные S pyogenes-инфицированных животные служили только в качестве внутреннего контроля за бактериальной инфекции. Оказавшись предположения о нормальности и равной дисперсии, сравнений между группами были проведены с использованием дисперсионного анализа (ANOVA), а затем соответствующий постфактум Сравнительный тест (SigmaStat, Jandel корпорации "Сан-Рафаэль, Калифорния). Критерий значимости принимался равным р <0,05.




РЕЗУЛЬТАТЫ
TOP
АННОТАЦИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ
ОБСУЖДЕНИЕ
Ссылки


Выбор бактериального штамма и дозы инфекции
Во-первых, мы исследовали влияние различных S pyogenes штаммами Panc02 на клетки карциномы поджелудочной IN VITRO (кратность инфекции (МВД) = 25)). Большинство штаммов не посредниками значительное торможение роста или убийство деятельности. Однако, активности каспазы 3 испытания и суб-G1 пике анализ показал, что S pyogenes серотип М49 штаммом 591 оказывали серьезное цитотоксических реактивность, что наиболее вероятно, связано с индукцией апоптоза к-клеток поджелудочной железы раком мышиной (Panc02) и человека (Panc1, BxPC3, Capan2) происхождения (Рис 1 и данные не представлены). Следовательно, S pyogenes серотип М49 штаммом 591 был выбран для оценки из бактериолитический antitumoural терапии в VIVO. Бактерии были intratumourally применяться для максимального воздействия местных antitumoural и минимизации потенциального системного цитотоксичность.



Показать крупную версию (9K):
В этом окне | В новом окне | PowerPoint для преподавания
Рисунок 1 Количественный анализ апоптоза. (А) увеличение активности каспазы 3 в Panc02 клеток после заражения S pyogenes М49 дикого типа (WT), ориентировочный для индукции апоптоза, что было подтверждено (B) цитофлуориметрического суб-G1 анализ пика. Клеток с содержанием ДНК ниже G1 пике считались апоптозу. Результаты показывают данные из трех отдельных экспериментах. (C) Panc02 клетки показывают характерное суб-G1 пики на 4 ч постинфекционные (представительных результатов из трех независимых экспериментов). Средние (СЭМ); * P <0,05 по сравнению с контролем; ** P <0,001 по сравнению с контролем, рассчитанная на основе анализа дисперсий.




Далее, мы стремились оценить оптимальное терапевтическое, нетоксичны числа инфекций. Увеличивается количество бактерий вводили (105, 106 и 107 КОЕ / мл). Животные группой, получавшей высокие дозы бактериальных стремительно развились серьезные признаки системная инфекция и умер (Рис 2). В противоположность этому, только два животных (15%) умерли от администрации S pyogenes в среднем (106 КОЕ / мл) и низким (105 КОЕ / мл) бактериальной дозах, соответственно, еще 4 недели постинфекционные. Для IN VIVO применения, высокая допустимых доз была выбрана (106 КОЕ / мл).



Показать крупную версию (18K):
В этом окне | В новом окне | PowerPoint для преподавания
Рисунок 2 Кривая выживаемости мышей с C57Bl/6N гетеротопической сингенных поджелудочной железы. После создания опухоли мыши получали одну инъекцию intratumoural S pyogenes и контролировалась в течение 28 дней с соблюдением этических требований. Для оценки оптимальных терапевтических дозах, бактерии вводились в трех различных дозах. Эксперимент как минимум пять мыши на каждую группу.





Валовая выводов после заражения S pyogenes
Intratumoural администрация S pyogenes не влияет Рост рак поджелудочной железы в течение первых 4 дней. Ощутимая опухоли продолжали расти и достигли среднего размера 128,6 (11.8) мм3), Которая была сопоставима с размерами опухоли транспортного средства обращению животные (151,9 (11,8) мм3). Затем, примерно 6-8 дней после заражения, опухолей в группе инфекция стала заметно и количественно меньше, чем у контрольной группы (р <0,05 по сравнению с контролем и транспортных средств; Рис 3), И часто язвенных и, видимо, necrotised 10-14 дней после заражения (Рис 3). Это в конце концов привели к почти полной регрессии в течение 4 недель.



Показать крупную версию (23K):
В этом окне | В новом окне | PowerPoint для преподавания
Рисунок 3 Кинетики роста опухолей у животных на 7, 14, 21 и 28 дней после intratumoural бактериальные инфекции и после rechallenge. Животные получали tumourigenic доза Panc02 клеток. Naïve М49-C животные были использованы в качестве контроля. Мыши, которые произошли бактериолитический терапии были частично защищены от повторного воздействия Panc02 клеток. Средние (СЭМ); * P <0,05 против опухоли; р <0,05 против транспортного средства; р <0,05 против М49-C rechallenge, рассчитанная на основе анализа дисперсий.




Проанализировать частоту системной распространения S pyogenes, Мы никелированная образцов крови от всех инфицированных животных в данном Время точек на овец кровяной агар, выявление системных бактериальных инфекции у 2 из 28 несущих опухоли мышей и ни в одном из 12 опухолей, свободных, животные М49 контроля. Два системное инфицированными животными отображается отсутствие аппетита, потеря веса и атаксии. Из-за тяжести инфекции, эти животные были euthanised и сопутствующих данных исключена.

После периода наблюдения (1, 2, 3 и 4 недели), животные были принесены в жертву. Макроскопическое исследование показало органов не имеет побочных эффектов, таких как некроз или кровоизлияние, но не было массовые спленомегалия лишь в несущих опухоли мышей, которые подверглись бактериолитический терапии (примерно семь-восемь раз в Увеличение размера во всех временных точках, данные не представлены). Интересно, селезенке опухолей, свободных мышей, инфицированных S pyogenes Были Макроскопически не увеличена.

Аналогичным образом, в день 14 постинфекционные, животные в лечении Группа выставлена исключительно переходных лейкоцитов (р <0,05 по сравнению с контролем и транспортных группах, соответственно), а также устойчивое Падение уровня гематокрита (р <0,05 по сравнению с контролем, и транспортное средство) (Таблица 1). Устойчивый низкого уровня гематокрита отрицательно коррелируют селезенки размеров.23 В этом случае, снижение гематокрита может свидетельствовать о расширении объемов лейкозом.


Просмотр этой таблице:
В этом окне | В новом окне
Таблица 1 Системный анализ крови клеток и гематокрита в контрольных группах (контроль, М49-C, опухоли, транспортного средства) и 7, 14, 21 и 28 дней после S pyogenes инфекция





Опухоль rechallenge демонстрирует лишь частичную защиту
Чтобы проверить, в какой степени бактериолитический терапия не только привело к регрессии опухоли, а также индуцированные защитные иммунологические к памяти повторного воздействия Panc02 клеток опухоли, опухоль rechallenge был проведен эксперимент. Группа состояла животных , которые были опухолей, свободных после лечения и наивно М49-C мышей. Оба получили tumourigenic доза Panc02 клеток в противоположного фланга. Через четыре недели после инокуляции опухоли, М49-C мыши отображается растущие опухоли (889,5 (245,7) мм3) (Рис 3). В rechallenge группе, развитие опухолей был значительно сдержанный (226,6 (71,3) мм3, Р <0,05) (Рис 3), С одного животного Остальные опухоль бесплатно до конца эксперимента. Взятые В совокупности это означает, что терапия с использованием бактериолитический М49 мощным связующим звеном antitumoural реактивности VIVO. Однако, только одна из шести животных был полностью защищен от повторного контакта Panc02 с опухолевыми клетками.


Проникновение лейкоцитов в опухоли следующие intratumoural инъекций S pyogenes
Чтобы оценить степень лейкоцитарной инфильтрации в качестве меры местного antitumoural ответ после заражения S pyogenes, опухолевой ткани были впервые изучены гистологии CAE (Рис 4). Эти эксперименты показали, в соответствии с системными лейкоцитоз, положительное окрашивание отдельные лейкоциты, с наивысшими значения на 7 дней и 14 после бактериальные инфекции (р <0,05 по сравнению с контролем и транспортных средств, Рис 4C), Но остался на значениях мере в три раза выше, чем у контрольных животных.



Показать крупную версию (48K):
В этом окне | В новом окне | PowerPoint для преподавания
Рисунок 4 Представитель изображений лейкоцитарной инфильтрацией тканей поджелудочной транспортного средства после лечения (А) или в день 7 (б) после S pyogenes инфекции. (C) Количественный анализ хлорацетат эстераза (CAE)-положительных лейкоциты проникают в ткани опухоли. Данные из контрольной группы являются репрезентативными для других точек времени (Original увеличения, X40). Средние (СЭМ); * P <0,05 против опухоли; р <0,05 против транспортного средства, рассчитанные на основе анализа дисперсий.




Как показано в Рис 5, Большинство из этих проникновение клеток Были гранулоцитов (CD88-положительных) и CD4+ Т-клеток, при цитотоксической Т-клетки (CD8-положительных) оказались заметно в некротической регионов опухоли (Рис 5). Кроме того, воспалительными клетками были только редко выявляются опухоли в контроле, и среди них было нет CD4+ или CD8+ Т-клеток и CD88+ гранулоцитов.



Показать крупную версию (139K):
В этом окне | В новом окне | PowerPoint для преподавания
Рисунок 5 Представитель изображений CD4, CD8 и CD88 иммуногистохимическое окрашивание тканей опухоли поджелудочной железы после транспортное средство лечения (A, D, G) или в день 7 (B, E, H) и День 21 (C, F, I), после S pyogenes инфекции (106 КОЕ / мл, n = 7 в момент времени). Обратите внимание на массовое накопление CD4-положительные Т-хелперов и гранулоцитов в рамках бактериально инфицированной опухолевой ткани (в оригинале увеличения, X40).





Определение спленоцитов подмножеств цитофлуориметрического анализ
Далее, мы проанализировали состав иммунных клеток селезенки (Таблица 2). Мы наблюдали высота макрофаги и моноциты (CD11b+) а также пожилые гранулоцитов (Gr1+) В течение первых 2 недель инфекции (Таблица 2). Количество трансферрин рецептор-позитивные (CD71) клетки были существенно подняты, а выражение L-селектин (CD62L) постепенно downregulated. Уровень CD4+ (Т-хелперы), CD8+ (цитотоксические) и CD25+ Т-клеток были слегка повышенной в течение первых 3 недель постинфекционные (Таблица 2). Однако, резкое снижение числа CD4+ а также CD8+ Т-клеток в день 28 отражает возможности миграции иммунологических эффекторных клеток больше в лимфоидной ткани, чем в селезенке.


Просмотр этой таблице:
В этом окне | В новом окне
Таблица 2 Анализ спленоцитов подмножества в контрольных группах (контроль, М49-C, опухоли, транспортного средства) и 7, 14, 21 и 28 дней после S pyogenes инфекции (%)





Изменения уровня цитокинов в результате инфекции
Данные, описанные выше указанных воспалительной реакции в опухолевой ткани из-М49 лечение животных. Таким образом, мы думали ли системный эффект может быть измерена в дополнение к этим местных явлениях. Сывороточные уровни цитокинов были определены из инфицированных и неинфицированных животных. Анализ хемотаксис нейтрофилов полипептид Г-КСФ показали 158,5 (33,8) и 21,1 (4,6) увеличения в дни 3 и 7, соответственно, после S pyogenes лечение, если по сравнению с контрольными значениями (р <0,001, Рис 6). Кроме того, Мы обнаружили значительное увеличение для ИФН IL3 и на 7 дней, с Возврат к почти физиологического значения всех трех Th1 цитокинов в более поздние моменты времени (Таблица 3), Что свидетельствует о сильном провоспалительных раздражителем, особенно на ранних фазах S pyogenes инфекции. Аналогичная картина была видна ФНО (Таблица 3). На 14 день, S pyogenes инфекция, возникающая в пять раз увеличить IL5 и 15-кратное увеличение В IL6, а затем троекратное увеличение ГМ-КСФ уровнях на день 21 (Таблица 3).



Показать крупную версию (16K):
В этом окне | В новом окне | PowerPoint для преподавания
Рисунок 6 Кинетика цитокинов колоний гранулоцитов стимулирующего фактора (Г-КСФ) в ходе экспериментального ход времени. Животные, которые были инфицированы intratumourally с S pyogenes показали огромное увеличение Г-КСФ на 3-й день после лечения, в то время никаких существенных различий были измерены в контрольных животных. Результаты показывают данные из трех мышей в момент времени. Средние (СЭМ); * P <0,05 против опухоли; р <0,05 против транспортного средства, рассчитанные на основе анализа дисперсий.





Просмотр этой таблице:
В этом окне | В новом окне
Таблица 3 Сыворотка цитокинов деятельности в контрольных группах (контроль, М49-C, опухоли, транспортного средства) и 7, 14, 21 и 28 дней после S pyogenes инфекция





Лимфоциты инфицированных животных конкретно признать опухолевых клеток
Далее мы рассмотрели ли иммунных клеток реагировать на раздражение опухоль из клеток. Во-первых, реакция сотрудничество спленоцитов-инкубации ночь с различной целевой популяции клеток было измерено В IFNELISPOT-анализов. Panc02 клеток опухоли вызвало IFN освобождение исключительно в спленоцитов получены от М49 обращению животных. Однако эта реакция была статистически значимым только в День 14 постинфекционные (р <0,05 по сравнению с контролем и транспортных средств; Рис 7A). Интересно, что аналогичные результаты были получены с другими изогенный Опухоль клеточных линиях, таких, как линия лимфома EL4 клетки и колоректальный рак клеток CMT-93 (Рис 7A). Мы определяется следующим реактивность спленоцитов, не обладающим раковая клетка контроль Линии, чтобы исключить неспецифическую реакцию. Что касается IFN освобождение, ни один из лейкоцитов показал реактивностью против сингенных MC3T3-E1 фибробласты или PBMCs (Рис 7B).



Показать крупную версию (22K):
В этом окне | В новом окне | PowerPoint для преподавания
Рисунок 7 Количественный анализ интерферона (IFN)ELISPOT-тесте. Реактивность спленоцитов против опухоли целью была испытана после совместной инкубации в течение ночи при Effector: клетки-мишени отношением 30:1. СПЛЕНОЦИТАХ от инфицированных животных на 7, 14, 21 и 28 дней после intratumoural бактериальные инфекции показали значительно более высокую реактивность против клеток-мишеней, чем те, от контрольных животных (28 день). Данные из контрольной группы являются репрезентативными для других точек времени. Удивительно, что реакционная спленоцитов против Panc02, EL4 и CMT-93 клеток (A) сократился с 7 дней до 28 после заражения. Кроме того, лимфоциты показал не реакционный против MC3T3-E1 фибробласты или мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) (B) во время периода инфекции, подчеркивая опухолевую клетку конкретной деятельности. Результаты показывают данные из трех отдельных экспериментах. Средние (СЭМ); * P <0,05 против опухоли; р <0,05 против транспортного средства, рассчитанные на основе анализа дисперсий.




В более функциональных анализов цитотоксичность, мы использовали лимфоциты получены из лимфатических узлов эффекторных клеток. Опять же, лимфоциты из S pyogenes-мышей признана Panc02 клеток опухоли, но лимфоцитов с контрольными животными, не показывают литической активности. Следует отметить, что убийство активность лимфоцитов Опухоль-инфицированных постоянно увеличивается группа постинфекционные (р <0,05 по сравнению с контролем и транспортных средств; Рис 8A). Кроме того, другие изогенный опухоли клеточных линий (EL4 и CMT-93) было также эффективно лизированные (Рис 8A). Опухоль специфики могут быть подтверждены отсутствуют или маргинальных цитотоксичности против не раковые клетки контроль (MC3T3-E1 и PBMCs) (Рис 8B). Таким образом, признание опухолевых клеток в предыдущих экспериментах и конкретные предложения индукции специфического иммунного ответа, что способствует к регрессии опухоли наблюдается в S pyogenes-инфицированными животными.



Показать крупную версию (24K):
В этом окне | В новом окне | PowerPoint для преподавания
Рисунок 8 Количественный анализ цитотоксичности помощью лактатдегидрогеназы анализа освобождении. Лимфоциты были изолированы от брыжеечных лимфатических узлов и сотрудничества с культурными целями в течение 24 ч при Effector: клетки-мишени отношением 30:1. Лимфоциты от инфицированных животных на 7, 14, 21 и 28 дней после intratumoural бактериальные инфекции показали значительно более высокой литической активности против клеток-мишеней, чем те, от контрольных животных (28 день). Цитотоксичности лимфоцитов против (А) Panc02, EL4 и CMT-93 клеток увеличилось с 7 дней до 28 после инфицирования, до> 50%. В отличие от этого, не литической активности лимфоцитов против (б) не раковая MC3T3-E1 был замечен клеток или мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs). Данные из контрольной группы являются репрезентативными для других точек времени. Результаты показывают данные из трех отдельных экспериментах. Средние (СЭМ); * P <0,05 против опухоли; р <0,05 против транспортного средства, рассчитанные на основе анализа дисперсий.







ОБСУЖДЕНИЕ
TOP
АННОТАЦИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ
ОБСУЖДЕНИЕ
Ссылки

Учитывая неблагоприятный прогноз пациентов с поздними стадиями поджелудочной железы рак и неудовлетворительным результатам стандартных терапевтических вмешательств, развиваются новые стратегии лечения является императивом. Таким образом, мы изучили antitumoural потенциал бактериолитический терапии, основанной на факультативных анаэробных бактерий. Мы выбрали S pyogenes в качестве модели бактериальный штамм, так как оно может оказывать прямое цитолитический последствий для эукариотических клеток,24 25 опосредовано целым рядом цитотоксических ферментов и порообразующих токсинов.26 27 Среди них haemolysins стрептолизин S и стрептолизином О, кажется, играют ключевую роль.25 28 29 В ходе предварительных расследований в VITRO, Мы обнаружили, что S pyogenes Действительно серьезным связующим звеном лечения рака поджелудочной железы Сотовый травмы (неопубликованные данные). Другая причина для использования S pyogenes является исключительная чувствительность стрептококков к пенициллину, которая позволяет легко искоренение следующих терапевтического применения.17 В качестве модели поджелудочной железы, мы избрали агрессивно растет, плохо иммуногенной модель мыши Panc02.18 Эти опухоли показать внутреннюю нечувствительность к противоопухолевых агентов.18 30--32

Есть важных и актуальных особенностей, общих для инфекции с S pyogenes у мышей и человека инфекции: (1) быстрое клетка ущерба после инфицирования, сопровождается язвы и некрозы инфицированной ткани; (2) значительный и устойчивый высота провоспалительных цитокинов (ФНО, IFN) И хемокинов (Г-КСФ); (3) высокий приток воспалительными клетками врожденной иммунной системы (например, нейтрофилы, макрофаги и ЕК-клетки) в фокус инфицирования, и (4) активизация адаптивных, клеточный иммунный ответ.16 33--35 Кроме того, внутривенное введение живых бактерий вызывает сильную токсичность.25 36 Учитывая эти факты и упомянутые выше требования для непосредственного бактериального и опухоли контакт клетка, мы сосредоточились на местном, intratumoural раствор для инъекций, а не на системные приложения.

Заметным результатом нынешних экспериментах была полная регрессии опухоли в течение 4 недель после intratumoural Администрация жить S pyogenes. Это antitumoural эффекта предлагает активное участие в руке врожденной иммунной системы. В поддержку этого толкования, было установлено, , что на начальном этапе S pyogenes инфекции, врожденные иммунных клеток, то есть, гранулоциты, моноциты-макрофаги, и являются основные эффекторы ответивших на работу в месте инфекции.9 28 33 34 Наши наблюдения решительно выступает за текущий воспалительный ответ: Эти замечания относятся гранулоциты (CD88-положительных), которые массово проникнуть инфицированы опухолей; значительное увеличение селезенки гранулоциты и моноциты и макрофагов (CD11b-положительных), а также системные производство провоспалительных цитокинов, таких как IL3, IFN и ФНО. Первичный Цель этого воспалительного ответа является предотвращение системных распространения бактерий,9 главным образом весьма эффективными фагоцитарной Деятельность мышиных макрофагов, которые особенно способны убийство стрептококков.28 36

IN VITRO функционального анализа показали, что специфический иммунный ответных мер в области IFN релиз был ограничен иммунных клеток получено от бактерий М49-лечение опухолевых животных. Этот найти дополнительно поддерживается в лимфоцитах ' потенциальные признать Panc02 клеток в цитотоксичности. Опухоль была специфика далее подчеркнули, из-за отсутствия реактивности в не-раковые клетки контроля. Интересно отметить, что мы также наблюдали перекрестная реактивность этих лимфоцитов с клетками других изогенный опухоль лица, возможно, объясняется наличием лимфоцитов признании общих опухолевых антигенов.

Чтобы объяснить нашим данным, мы предлагаем следующую модель. Intratumourally ведение S pyogenes вызывает проникновение воспалительного клеток из периферической крови в зараженных тканях,29 37 где они занимают инфицированные клетки, чтобы очистить бактериальной инфекции. В крылом лимфатические узлы, компоненты клеточной мусора Приводятся другие иммунные клетки. Как следствие текущие воспаления и активированного статус представления клеток, специфических иммунных ответов легко может быть возбуждено. Это Можно предположить, что в этом контексте, опухоль-специфичный иммунный Ответы также срабатывает.37 Таким образом, животные находятся на хотя бы частично защищены от опухоли rechallenge. Однако, частичный характер этого защитного иммунитета дальнейшие намеки на необходимость сильного воспалительного стимулы к ликвидации Опухоль бремя полностью.

Насколько нам известно, мы являемся первыми, чтобы показать, что S pyogenes Первоначально инфекция активизируется иммунная система и приводит к генерации опухоли конкретного эффекторных клеток, способствуют регрессии поджелудочной железы. Эта гипотеза подкрепляется выводами других групп, которые использовали инактивированной S pyogenes подготовка (ОК-432) для лечения несколько типов экспериментальных опухолей. Полезность ОК-432 IN VIVO для созревания дендритных клеток приводит к индукции устного опухоли конкретного цитотоксических Т-лимфоцитов в сочетании с применением химиотерапевтических агентов не было продемонстрировано.38 Кроме того, Ono и др. доказали полезность ОК-432 как вакцинация адъювантной в сочетании с опухолью конкретного эпитопом Т-клеток.39 Вопреки нашим выводам с помощью одного intratumoural инъекций живых бактерий, экспериментальные опухоли бывшего исследований не в полной регрессии для последующего лечения. Впечатляющие Опухоль ставок искоренение аналогичных тем, которые наблюдались нами Были, однако, сообщили Avogadri и др. использование ослабленных Сальмонелла.37 Интересно, что высокая реакционная antitumoural строго зависит от расширенный репертуар Сальмонелла-специфичных Т клеток проделанной prevaccination протокола.

Взятые вместе, мы показали, что бактериолитический иммунотерапия использование факультативных анаэробных бактерий, таких как S pyogenes является перспективной новой стратегии для лечения поздних стадий поджелудочной железы карцинома, которая требует дальнейшего изучения.
















БЛАГОДАРНОСТЬ

Мы благодарим д-р Крюгер B для обеспечения доступа к Cytofluor 2300.




ПРИМЕЧАНИЯ

Конкурирующие интересы: Ни объявлены.


Published Online первых 19 ноября 2007



Ссылки
TOP
АННОТАЦИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ
ОБСУЖДЕНИЕ
Ссылки


Staib L, Link KH, Beger HG. Иммунотерапии при раке поджелудочной железы текущем статусе и будущем. Лангенбеку Arch Surg 1999; 384: 396-404.[CrossRef][Medline]
Wiemann B, токсины Starnes CO. Coley's, фактор некроза опухолей и рака исследования: историческая перспектива. Там Pharmacol 1994; 64: 529-64.[CrossRef][Medline]
Suzuki S, Shinohara N, Harabayashi Т, и др.. Осложнения БЦЖ терапии в поверхностные urothelial железы: клинический анализ и последствия. Int J Clin Oncol 2002; 7: 289-93.[Medline]
Исии KJ, Каваками К Gursel I, и др.. Противоопухолевой терапии с ДНК бактерий и токсинов: полная регрессия опухоли создан индуцированных липосомальная олигодезоксинуклеотиды CpG плюс интерлейкин-13 цитотоксин. Clin Cancer Res 2003; 9: 6516-22.[Аннотация /БесплатноПолный текст статьи]
Melief CJ, пальцы RE, Medema ДП, и др.. Стратегии для иммунотерапии злокачественных новообразований. Adv Immunol 2000; 75: 235-82.[Medline]
Пастан я Kreitman RJ. Иммунотоксины для целенаправленной терапии рака. Adv Drug Deliv Rev 1998; 8: E532-51.
Yazawa K, M Фухимори, Nakamura T, и др.. Bifidobacterium Longum как система доставки для генной терапии рака: избирательная локализация и рост в гипоксической опухолей. Cancer Gene Там 2000; 7: 269-74.[CrossRef][Medline]
Yazawa K, M Фухимори, Nakamura T, и др.. Bifidobacterium Longum как система доставки для генной терапии химическим индуцированных опухолей крыс молочной железы. Breast Cancer Res Treat 2001; 66: 165-70.[CrossRef][Medline]
Agrawal N, Bettegowda C, Cheong I, и др.. Бактериолитический терапия может генерировать мощный иммунный ответ в отношении экспериментальных опухолей. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 15172-77.[Аннотация /БесплатноПолный текст статьи]
Данг ЛГ, Bettegowda C, Huso DL, и др.. Бактериолитический Комбинированная терапия при лечении экспериментальных опухолей. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 18: 15155-60.
Чжао М, Ян М, Li XM, и др.. Опухоль ориентации антибактериальная терапия с аминокислотой ауксотрофов GFP-выразив Typhimurium сальмонеллы. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: 755-60.[Аннотация /БесплатноПолный текст статьи]
Lowenfels А.Б., Maisonneuve P. эпидемиология и факторы риска развития рака поджелудочной железы. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2006; 20: 197-209.[CrossRef][Medline]
Бруэлл D, Bruns CJ, Yezhelyev М, и др.. Рекомбинантные анти-EGFR антитоксин 425 (ScFv)-ЭТА 'демонстрирует противоопухолевой активностью в отношении распространяемых человека рака поджелудочной железы в ню мышей. Int J Mol Med 2005; 15: 305-13.[Medline]
Kalady М.Ф., Onaitis МВт, EMANI S, и др.. Дендритных клеток с импульсным рак поджелудочной железы общей опухолевой РНК генерировать конкретные antipancreatic Т-клетки рака. J Gastrointest Surg 2004; 8: 175-81.[CrossRef][Medline]
Шнайдер C, Schmidt T, Ziske C, и др.. Опухоль подавление индуцированной активации макрофагов lipopeptide MALP-2 в Эластическая поджелудочной мышиной модели рака. Гут 2004; 53: 355-61.[Аннотация /БесплатноПолный текст статьи]
Tepel J, Dagvadorj O, Kapischke М, и др.. Значительное торможение роста ортотопической протоковой аденокарциномы поджелудочной железы от CpG олигонуклеотиды в иммунодефицитных мышей. Int J колоректального Дис 2006; 21: 365-72.[CrossRef][Medline]
Каннингем М. Патогенез группа стрептококковой инфекции. Clin Microbiol Rev 2000; 13: 470-511.[Аннотация /БесплатноПолный текст статьи]
Корбетт TH, Робертс BJ, Леопольд WR, и др.. Индукция и химиотерапевтических ответ из двух перевивной протоковой аденокарциномы поджелудочной железы в C57BL / 6. Cancer Res 1984; 4: 717-26.
Klenk М, Koczan D, Guthke R, и др.. Глобальная эпителиальная клетка транскрипционную ответы свидетельствуют Streptococcus pyogenes Fas регулятором деятельности ассоциации с бактериальной агрессии. Cell Microbiol 2005; 7: 1237-50.[CrossRef][Medline]
Джастер R, Lichte P, Fitzner B, и др.. Пероксисома распространителем активированного экспрессией рецепторов гамма ингибирует про-фиброгенных деятельности увековечен крыса звездчатых клеток поджелудочной железы. J Cell Mol Med 2005; 9: 670-82.[Medline]
Мартен, Ziske C, Schottker B, и др.. Взаимодействия между дендритных клеток и цитокин-индуцированный убийцу клеток приводит к активации обоих народов. Cancer Gene Там 2001; 24: 502-10.[Medline]
Шань Б.Е., Хао JS, Li QX, и др.. Противоопухолевой активности и повышению иммунного мышиный интерлейкин-23 выразили в мышиных клетках карциномы толстой кишки. Cell Mol Immunol 2006; 3: 47-52.[Medline]
Черви D, G Клемент, Stempak D, и др.. Ориентация циклооксигеназы-2 снижает токсичность открытые в сторону низких доз винбластин и расширяет выживания несовершеннолетних мышей с болезнью другу. Clin Cancer Res 2005; 15: 712-9.
Куинн RW, Лоури PN. Влияние pyogenes Streptococcus на клетки тканей. J Bacteriol 1967; 3: 1825-31.
Sierig G, Cywes C, Wessels М.Р., и др.. Цитотоксические эффекты стрептолизин O и S стрептолизин повышение вирулентности плохо инкапсулированы группа стрептококков. Infect Immun 2003; 71: 446-55.[Аннотация /БесплатноПолный текст статьи]
Marouni MJ, Sela С. Судьбы Streptococcus pyogenes и эпителиальных клеток после интернализации. J Med Microbiol 2004; 53: 1-7.[Аннотация /БесплатноПолный текст статьи]
Молинари G, Rohde М, Талай SR, и др.. Роль, которую играет группа стрептококковой негативный регулятор НРА по бактериальным взаимодействия с эпителиальными клетками. Mol Microbiol 2001; 40: 99-114.[CrossRef][Medline]
Гольдман O, Rohde М, Чхатвала GS. Роль макрофитов в резистентность к группе стрептококков. Infect Immun 2004; 72: 2956-63.[Аннотация /БесплатноПолный текст статьи]
Hryniewicz Вт, Pryjma J. Влияние стрептолизин S по правам человека и мыши Т-и В-лимфоцитов. Infect Immun 1977; 16: 730-3.[Аннотация /БесплатноПолный текст статьи]
Priebe Т.С., Аткинсон Е.Н., пан Б.Ф., и др.. Внутреннее сопротивление противораковые агенты в мышиной PANC02 аденокарциномы поджелудочной железы, Cancer Chemother Pharmacol 1992; 29: 485-9.[CrossRef][Medline]
Шмидт T, Ziske C, куница, и др.. Внутриопухолевые иммунизации с опухолевой РНК-импульсной дендритных клеток дает противоопухолевый иммунитет C57BL / 6 опухоли поджелудочной модели на мышах. Cancer Res 2003; 63: 8962-7.[Аннотация /БесплатноПолный текст статьи]
Wilkoff LJ, Dulmadge EA. Чувствительность пролиферирующих культурный мышиных опухолевых клеток поджелудочной железы в избранное противоопухолевых препаратов. J Natl Cancer Inst 1986; 77: 1163-9.[Medline]
Гольдман O, Чхатвала Г.С., Медина Е. Вклад естественных киллеров в патогенезе септического шока, порожденного Streptococcus pyogenes у мышей. J Infect Dis 2005; 191: 1280-6.[CrossRef][Medline]
Медина Е, Гольдман O, Rohde М, и др.. Генетический контроль чувствительности к группе стрептококковой инфекции в организме мышей. J Infect Dis 2001; 184: 846-52.[CrossRef][Medline]
Медина Е, Гольдман O, Toppel AW, и др.. Выживание pyogenes Streptococcus в принимающих фагоцитарной клетки: патогенный механизм для сохранения и системные вторжения. J Infect Dis 2003; 187: 597-03.[CrossRef][Medline]
Гольдман O, S Чхатвала, Е. Медина Иммунная механизмы, лежащие в принимающей восприимчивость к инфекции группы стрептококков. J Infect Dis 2003; 187: 854-61.[CrossRef][Medline]
Avogadri Ж, Martinoli C, L Петровского, и др.. Иммунотерапии основаны на убийство сальмонеллы-инфицированных клеток опухоли. Cancer Res 2005 1; 65: 3920-7.
Ахмед SU, Окамото М, Oshikawa Т, и др.. Противоопухолевого эффекта от внутриопухолевые администрация дендритных клеток в сочетании с ТС-1, устное анти fluoropyrimidine рака наркотиков и ОК-432, стрептококковой иммуностимулятор: участие Toll-подобных рецепторов 4. J Immunother (1997). 2004; 27: 432-41.[Medline]
Оно Т, М Харада, Yamada, и др.. Противоопухолевый эффект системной и местной иммунизации CTL-направленного пептида в сочетании с местным введением ОК-432. Clin Cancer Res 2006 15; 12: 1325-32.

CiteULike Complore Connotea Del.icio.us Digg Reddit Technorati Что это?
Соответствующая статья


Дайджест
Робин Шпиллер и Магнус Simren
Gut 2008 57: 1-2. [Выдержка] [Полный текст] [PDF]

Эта статья цитируется в других статьях:

NAGAKURA, C., Hayashi K., Zhao, М., Ямаути, К., Yamamoto N., Tsuchiya, H., Tomita K., Буве, М., Хоффман, RM (2009). Эффективность применения генетически измененных Typhimurium сальмонеллы в ортотопической Рак поджелудочной железы человека у мышей обнаженная. Портивораковый Res 29: 1873-1878 [Аннотация] [Полный текст]
Эта статья
Аннотация
Полный текст (PDF)
Все версии этой статьи:
gut.2007.125419v1
57/4/483последний
Оповещение меня, когда цитируется эта статья
Оповещение меня, если опубликовано коррекция
Цитирование карта
Услуги
Email эту ссылку другу
Подобные статьи в этом журнале
Подобные статьи в PubMed
Добавить статью Мои папки
Загрузить в Цитирование менеджера
Запрос разрешений
Ссылаясь на статью
Ежегодное изменение состава вакцины
Ссылаясь на статьи через Google Scholar
Google Scholar
Статьи по Maletzki, C
Статьи по Emmrich, J
Поиск Связанные элементы
PubMed
PubMed Цитирование
Статьи по Maletzki, C
Статьи по Emmrich, J
Рубрика коллекций
Рак поджелудочной железы

Поджелудочной железы и желчных путей
Соответствующая статья

Закладка с

Что это?
Регистрация для бесплатного контента
Полный архив обратно теперь доступна для всех BMJ журналах. Институциональные абонентов может получить доступ ко всему архиву в рамках своей подписки. Личный абоненты также будут иметь доступ ко всему содержимому, когда прошли идентификацию Non-абонентов, которые зарегистрировались иметь свободный доступ для всех статей, опубликованных до 2006 года право вернуться к вопросу 1 Том 1. Зарегистрируйтесь здесь Для доступа к свободно архив всех BMJ журналах.


Не забудьте подписаться на содержание оповещений так что вы держите в курсе всех статей, которые публикуются.
http://gut.bmj.com/cgi/content/full/57/4/483