Article Статья


Nature Biotechnology 24 , 191 - 197 (2006) Природа Биотехнология 24, 191 - 197 (2006)
Published online: 15 January 2006; | doi:10.1038/nbt1179 Опубликовано на сайте: 15 января 2006 года; | DOI: 10.1038/nbt1179
Characterization and identification of vaccine candidate proteins through analysis of the group A Streptococcus surface proteome Характеристика и определение вакцин кандидат белков на основе анализа группы Streptococcus поверхность ПРОТЕОМА
Manuel J Rodríguez-Ortega, Nathalie Norais, Giuliano Bensi, Sabrina Liberatori, Sabrina Capo, Marirosa Mora, Maria Scarselli, Francesco Doro, Germano Ferrari, Ignazio Garaguso, Tiziana Maggi, Anita Neumann, Alessia Covre, John L Telford & Guido Grandi Мануэля Родригеса J-Ортега, Натали Norais, Джулиано Bensi, Сабрина Liberatori, Сабрина Капо, Marirosa Мора, Мария Scarselli Франческо Доро, Germano Ferrari, Ignazio Garaguso, Тициана Maggi, Анита Неймана, Alessia Covre, Джон L Telford И Гвидо Grandi

Chiron Vaccines, Via Fiorentina, 1 53100 Siena, Italy. Хирон Вакцины, Виа Фиорентина, 1 53100 Сиена, Италия.

Correspondence should be addressed to Guido Grandi guido_grandi@chiron.com Корреспонденция должна быть адресованы Гвидо Grandi guido_grandi@chiron.com




We describe a proteomic approach for identifying bacterial surface-exposed proteins quickly and reliably for their use as vaccine candidates. Мы описываем протеомических подхода для выявления бактериальной поверхности подвергаются белки быстро и надежно для использования их в качестве вакцин. Whole cells are treated with proteases to selectively digest protruding proteins that are subsequently identified by mass spectrometry analysis of the released peptides. Всего клетки обрабатываются протеаз избирательно дайджест оттопыренными протеины, которые впоследствии определили масс-спектрометрии анализа пептидов освободили. When applied to the sequenced M1_SF370 group A Streptococcus strain, 68 PSORT-predicted surface-associated proteins were identified, including most of the protective antigens described in the literature. При применении к секвенированы M1_SF370 группы Streptococcus штамма, 68-PSORT предсказал поверхностных белков, связанных были выявлены, в том числе большинство защитных антигенов, описанных в литературе. The number of surface-exposed proteins varied from strain to strain, most likely as a consequence of different capsule content. Число поверхностных белков подвергаются разнообразным из штамма напрягаться, скорее всего, как следствие различных капсула содержание. The surface-exposed proteins of the highly virulent M23_DSM2071 strain included 17 proteins, 15 in common with M1_SF370. Поверхности подвергаются белки M23_DSM2071 высокой вирулентного штамма включала 17 белков, 15 совместно с M1_SF370. When 14 of the 17 proteins were expressed in E. Когда 14 из 17 белков, были высказаны в E. coli and tested in the mouse for their capacity to confer protection against a lethal dose of M23_DSM2071, one new protective antigen (Spy0416) was identified. коли и испытанные в мышь для их способность предоставлять защиту от смертоносных доз M23_DSM2071, один новый защитный антиген (Spy0416) были выявлены. This strategy overcomes the difficulties so far encountered in surface protein characterization and has great potential in vaccine discovery. Эта стратегия преодолевает трудности, до сих пор возникают в поверхностных протеинов квалификация и имеет огромный потенциал в вакцине открытий.


Bacterial surface proteins play a fundamental role in the interaction between the bacterial cell and its environment 1, 2, 3, 4, 5, 6 . Бактериальные поверхностные белки играют важную роль во взаимодействии между бактериальных клеток и окружающей среды 1, 2, 3, 4, 5, 6. They are involved in adhesion to and invasion of host cells, in sensing the chemical and physical conditions of the external milieu and sending appropriate signals to the cytoplasmic compartment, in mounting defenses against host responses and in toxicity. Они участвуют в адгезии и инвазии принимающих клеток, в зондирования химические и физические условия внешней среды и передача соответствующих сигналов к цитоплазматической отсека, в оборону против монтажа принимающей ответы и токсичности. Hence, surface proteins are potential targets of drugs aimed at preventing bacterial infections and diseases 7 . Таким образом, поверхностные белки являются потенциальными объектами препаратов, направленных на предупреждение бактериальных инфекций и заболеваний 7. Moreover, because surface proteins are likely to interact with the host immune system, they may become components of effective vaccines. Кроме того, поскольку поверхностные белки могут взаимодействовать с иммунной системой, они могут стать компонентами эффективных вакцин. Vaccines based on surface-exposed and secreted proteins are already commercially available and others are in development 8, 9 . Вакцины основывается на поверхности и подвергается секретированный белков уже коммерчески доступна, а другие находятся в процессе развития 8, 9.

Despite the biological relevance of bacterial surface proteins, their characterization is still incomplete. Несмотря на актуальность биологических бактериальных поверхностных белков, их характеристика по-прежнему неполными. This is mostly owing to difficulties in defining the protein composition and topology on the bacterial surface. Это в основном из-за трудностей в определении состава белка и топология на бактериальные поверхности. There are three main methods currently in practice to identify surface proteins. Существуют три основных метода в настоящее время на практике для выявления поверхностных белков. The first method is based on surface protein prediction by genome analysis using algorithms such as PSORT 10, 11 . Первый метод основан на поверхности белка прогнозирования путем анализа генома с помощью алгоритмов, таких, как PSORT 10, 11. The method is rapid but is not fully reliable and is not quantitative. Этот метод является быстрым, но не является полностью надежным, и не количественный характер. The second approach employs separation of membrane and cell wall fractions from the cytoplasmic fraction and then identification of proteins by two-dimensional (2D)-electrophoresis or 2D-chromatography coupled to mass spectrometry. Второй подход используется разделение мембраны и клеточной стенки от фракции цитоплазматической фракцию, а затем идентификации белков в двумерном (2D)-электрофорез или 2D-хроматографии в сочетании с масс-спектрометрии. This approach, which has been used in several bacteria 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , is reasonably quantitative. Этот подход, который был использован в некоторых бактерий, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, разумно количественный характер. However, it is not sufficiently selective and several cytoplasmic proteins contaminate the identified membrane proteins. Тем не менее, оно не является достаточно избирательно и несколько цитоплазматических белков контаминировать выявленных мембранных белков. Furthermore, neither of these first two approaches specifically identifies those proteins that actually extend beyond the cell wall and polysaccharide capsule into the extracellular milieu. Кроме того, ни один из этих двух подходов, конкретно определяются те белки, которые фактически выходят за пределы клеточной стенки и капсулы в полисахаридной внеклеточной среде. Finally, in the third approach, membrane proteins are first defined using one of the two methods described above and then surface localization is confirmed by producing polyclonal antibodies against the recombinant forms of each predicted protein and by assaying antibody binding to whole bacterial cells. Наконец, в третьем подходе, мембранные белки сначала определить с помощью одного из двух методов, описанных выше, а затем поверхность локализации подтверждается производству поликлональных антител против рекомбинантных форм каждого предсказал белка, а также анализ на антитела к обязательным всего бактериальных клеток. Although this method, recently used to identify vaccine candidates for group B Streptococcus 9 , is quantitative and does identify truly surface accessible proteins, it is extremely labor intensive. Хотя этот метод, в последнее время используется для идентификации вакцин для группы B Streptococcus 9, количественные и делает выявить действительно доступной поверхности белков, крайне трудоемким. Here we describe a new procedure that allows the rapid and selective identification of bacterial surface-exposed proteins, the pool of proteins which are entirely or partially exposed on the outside of bacterial cells. Здесь мы рассмотрим новую процедуру, которая позволяет быстро и селективного выявления бактериальной поверхности подвергаются белки, бассейн белков, которые полностью или частично выставлена на внешней поверхности бактериальной клетки. The method uses proteolytic enzymes to 'shave' the bacterial surface and the peptides generated are separated from the whole cells and identified by mass spectrometry. Этот метод использует протеолитических ферментов в 'брить' бактериальной поверхности и пептидов порожденных отделены от всего клеток и определили масс-спектрометрии. To demonstrate the power of the method, we present the characterization of the complete set of M1_SF370 group A Streptococcus (GAS) surface-exposed proteins. Для того, чтобы продемонстрировать силу этого метода, мы представляем характеризация комплект M1_SF370 группы Streptococcus (газа) на поверхности подвергаются белки. We show that 95% of the identified proteins belong to four protein families of predicted surface-associated proteins, most of which are accessible to polyclonal antibodies raised against the corresponding recombinant proteins. Мы показываем, что 95% из выявленных белков принадлежат четыре белковых семейств предсказал поверхности, связанных с белками, большинство из которых доступны поднятых поликлональных антител против рекомбинантных белков соответствует. We also show that the proteins identified include most of the protective antigens described in the literature and at least one new antigen capable of conferring consistent protection in the mouse against challenge with a virulent GAS strain. Мы также показали, что белки относятся большинство защитных антигенов, описанных в литературе, и по меньшей мере один новый антиген, способных присвоении последовательной защиты в борьбе с проблемой мышь с ГАЗ вирулентного штамма. Therefore, the approach represents a valuable tool to study surface protein organization and to identify new vaccine candidates. Таким образом, этот подход представляет собой ценный инструмент для изучения поверхности белка организации и в целях выявления новых вакцин-кандидатов.

Results Результаты
Analysis of M1_SF370 GAS strain Анализ M1_SF370 ГАЗ штамм
To identify the surface-exposed proteins of the completely sequenced M1_SF370 strain 19 , exponentially growing bacteria were collected and treated with either trypsin or proteinase K to shave the bacterial surface of exposed protein domains. Для выявления поверхностных подвергаются белки полностью секвенированы M1_SF370 штамма 19, экспоненциально растущей бактерии были собраны и лечение либо трипсин или протеиназы К бриться бактериальной поверхности облучаемой белка доменов. This treatment did not impair cell integrity as assessed by plating the bacteria before and after protease digestion (data not shown). Это лечение не нанести ущерб целостности клеток по оценке обшивки бактерий до и после протеазы пищеварения (данные не показаны). Peptides released into the supernatant were concentrated and analyzed by tandem mass spectrometry (MS/MS). Пептиды выпущено в супернатанта были сосредоточены и проанализированы тандем масс-спектрометрия (MS / MS). A total of 72 proteins were identified ( Fig. 1 and Supplementary Table 1 online): 37 from the matching of more than one peptide per protein, and 35 from single-peptide matching. В общей сложности из 72 протеинов было выявлено (рис. 1 и таблица 1 Дополнительная онлайн): 37 из сопоставления нескольких пептидных на белок, и 35 из одного пептида соответствия. Forty-three proteins were deduced from the trypsin-derived peptides, 18 proteins from the proteinase K–derived peptides and 11 proteins from both trypsin and proteinase K–derived peptides. Сорок три белки были выведены из-трипсин полученных пептидов, белков, 18 из протеиназы К-полученных пептидов и белков, 11 из трипсин и протеиназы К-полученных пептидов. From sequence analysis, the 72 proteins could be grouped into four major families: the cell wall–anchored family containing LPXTG-like motifs (12 proteins), the lipoprotein family (11 proteins), the transmembrane protein family (37 proteins) and the secreted-protein family (8 proteins). Из анализа последовательности, 72 белков могут быть сгруппированы в четыре основных семей: клеточной стенки-закрепленные семье, содержащей LPXTG-подобные мотивы (12 белков), липопротеина семьи (11 белков), трансмембранного белка семьи (37 белков), а секретированный -белка семьи (8 белков). Only four proteins predicted by PSORT to reside in the cytoplasmic compartment were found in the protease-sensitive fraction ( Supplementary Table 1 online). Только четыре белки предсказывают PSORT проживать в цитоплазматической отделении были обнаружены в протеазы учитывающие долю (дополнительные таблицы 1 в сети). They included the elongation factor Tu, reported to be membrane-associated in other bacteria 20, 21 , two ribosomal proteins, for which there is also evidence of extracellular functions 22, 23 , and a hypothetical protein possibly involved in cell wall localization and side-chain formation. Они включали в себя удлинение фактор Ту, по сообщениям, связанных с мембраной на других бактерий, 20, 21, два рибосомального белков, для которых есть доказательства внеклеточной функций 22, 23, и гипотетическими белка, возможно, участвуют в клеточной стенки локализации и побочные цепочке формирования.


Figure 1. The M1_SF370 surface proteome. Рисунок 1. M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА.

The 72 proteins belonging to the M1_SF370 surface proteome are grouped into families based on their predicted cellular location. 72 белков, входящих в M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА сгруппированы семей на основе их местоположения сотового предсказал. Red areas of each pie indicate the number of PSORT-predicted proteins that have not been found in the surface proteome, whereas the yellow areas represent the number of identified proteins belonging to each protein family. Красный районов каждого пирога указать количество PSORT предсказанных белков, которые не были обнаружены на поверхности ПРОТЕОМА, в то время как желтые районы представляют число выявленных белки, принадлежащие к каждой семье белка. The blue pies illustrate how many of the identified proteins have been confirmed to be surface-exposed by following antigen-specific antibody binding to whole bacterial cells using FACS analysis. Синий пироги показывают, как многие из указанных белков были подтверждены для поверхностного воздействия на следующий конкретный антиген-антитело обязательными для всего бактериальных клеток с помощью СУИМ анализа.



Full Figure and legend (59K) Полный Рисунок и легенда (59K)


Confirmation of protein surface exposure Подтверждение белка поверхности облучения
The almost complete absence of peptides from predicted cytoplasmic proteins suggested that the procedure was selective for the identification of surface-exposed proteins. Почти полное отсутствие пептидов из предсказал цитоплазматических белков высказано мнение, что процедура носит избирательный характер для выявления поверхностных подвергаются белки. To confirm this, we carried out two types of analysis. Чтобы подтвердить это, мы провели два вида анализа. First, we analyzed the 37 transmembrane proteins ( Supplementary Table 1 online) with PSORT topological prediction analysis and asked whether the MS/MS-identified peptides were located within domains predicted to be on the external side of the membrane. Во-первых, мы проанализировали 37 трансмембранный белки (Дополнительный Таблица 1 онлайн) с PSORT Топологический анализ и прогнозирование ли MS / MS-пептидов были определены расположенные в доменах прогнозам, будет на внешнюю сторону мембраны. For 26 out of 37 proteins experimental MS/MS data were consistent with PSORT predictions ( Fig. 2 ). Для 26 из 37 белков экспериментальной MS / MS данные согласуются с прогнозами PSORT (Рис. 2). In contrast, for the remaining 11 proteins, the identified peptides mapped either in domains predicted to be intracellular or, in two cases, embedded in the membrane. В отличие от этого, на оставшиеся 11 белков, пептидов определила карту либо в областях, по прогнозам, будет внутриклеточных или, в двух случаях, встроенных в мембраны. However, from manual inspection of the annotations, we came to the conclusion that the PSORT-predicted transmembrane organization of at least 6 out of 11 proteins ( Supplementary Table 1 online) should be revisited. Однако, начиная с руководства инспекции аннотации, мы пришли к выводу, что предсказал PSORT-трансмембранный организации, по крайней мере 6 из 11 белков (дополнительные таблицы 1 в сети), должны быть пересмотрены. In particular, the two peptides derived from the putative cell division protein Spy0015, homologous to the FtsH protein family, are located within a conserved protein domain known to be extracellular in FtsH proteins 24, 25, 26 . В частности, два пептиды, полученные от предполагаемого клеток белка Spy0015, гомологичен FtsH белкового семейства, находится в сохранение белка домена известно, внеклеточная в FtsH белков 24, 25, 26. The four peptides of Spy1520, a second putative cell division protein homologous to FtsZ, are located within the C-terminal part of the molecule, a region that in Bartonella bacilliformis is immunogenic and surface-exposed 27 . Четыре пептидов Spy1520, второй предполагаемый клеток белка FtsZ гомологичен, расположены в пределах С-терминал часть молекулы, что в регионе Bartonella bacilliformis это иммуногенность и поверхностных подвержены 27. The two hypothetical proteins Spy0351 and Spy2184 are likely to be lipoproteins rather than integral membrane proteins. Две гипотетические белки Spy0351 и Spy2184 могут липопротеидов, а не интегральных мембранных белков. In fact, their predicted transmembrane regions have a very poor PSORT score and therefore we expect them to completely extend out of the membrane. По сути, их предсказал трансмембранный регионы очень плохо PSORT баллов и поэтому мы надеемся, что они полностью продлить из мембраны. This is also supported by the presence, adjacent to their predicted leader-peptide cleavage sites, of the cysteine, which in lipoproteins is used as the anchor residue to the bacterial surface. Это также поддерживается за счет присутствия, прилегающих к их предсказал лидер-пептида спайности объектов, цистеин, которая в липопротеидов используется как якорь остатков на поверхности бактериальных. Spy1154 has two predicted transmembrane regions, the second of which has a very poor PSORT score (-0.32 as opposed to -8.12 of the first transmembrane region). Spy1154 два предсказал трансмембранный регионов, вторая из которых имеет очень плохие PSORT баллов (-0.32 по сравнению с -8,12 из первых трансмембранный обл.) If, as is likely, the prediction of the second transmembrane region were wrong, the C-terminal part of the molecule, which carries a typical sortase domain, would be exposed on the surface, which would be consistent with the mechanism of action of sortases 28 . Если, как это, вероятно, предсказание о втором трансмембранного региона были неправы, то C-терминал часть молекулы, которая несет в себе типичные sortase области, будет выставлена на поверхность, которая будет соответствовать механизм действия sortases 28. Finally, Spy0184, a putative glycine betaine binding–permease protein, is predicted to have six transmembrane regions, one of which has a poor score. Наконец, Spy0184, предполагаемый глицин betaine обязательного-permease белок, согласно прогнозам, иметь шесть трансмембранный регионов, один из которых имеет плохой балл. Again, if the weak transmembrane region were ignored, the topological organization would change and the C-terminal region, where the two MS/MS-identified peptides fall, would become surface-exposed. Опять же, если слабый трансмембранного региона были проигнорированы, Топологический организации изменится и С-концевой области, где два MS / MS-выявлены пептиды осенью, станет поверхности подвергаются. Indeed, polyclonal antibodies against the C-terminal domain of the protein efficiently bound GAS M1_SF370 whole cells when tested by fluorescence-activated cell sorting (FACS; data not shown). Действительно, поликлональные антитела против С-концевого домена из белка эффективно связаны ГАЗ M1_SF370 целом клеток при испытании на флуоресценцию активированных клеток сортировки (СУИМ; данные не показаны).


Figure 2. Topological analysis of the 37 surface-exposed proteins belonging to the membrane protein family. Рисунок 2. Топологические анализ 37 поверхностных белков подвергаются принадлежащие к мембране белкового семейства.

Each of the 37 membrane proteins belonging to the M1_SF370 surface proteome was subjected to PSORT topological prediction. Каждая из 37 мембранных белков, принадлежащих к M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА был подвергнут PSORT Топологический прогнозирования. ( a ) All proteins whose predicted topology is consistent with the experimental data are shown; the proteolytic peptides (shown in red in the figure) derived by protease treatment of whole cells are in fact located on domains protruding out of the membrane. () Все белки которого предсказал топологии согласуются с экспериментальными данными приведены; протеолитических пептидов (показан красным цветом на рисунке), полученных путем протеазы лечения целых клеток, по сути, расположенных на доменах выступающие из мембраны. ( b , c ) Shown are the 11 proteins showing discrepancies between in silico -predicted topology and experimental data (see text for details) and whose identification was deduced from the characterization of more than one ( b ) or one ( c ) peptide. (B, C) показано 11 белков с указанием различий между silico в предсказанным топологии и экспериментальные данные (см. текст в подробности) и идентификация которых была выведена из характеристик более чем одним (б), либо один (с) пептида.



Full Figure and legend (96K) Полный Рисунок и легенда (96K)


The second type of study was based on FACS analysis using protein-specific antibodies. Второй тип исследования была основана на анализе использования СУИМ белково-специфических антител. Mouse polyclonal antibodies were produced against 51 recombinant proteins selected from among the M1_SF370 surface-exposed proteins, and the antibodies were tested for their capacity to bind whole bacteria. Мыши поликлональные антитела были подготовлены в отношении 51 рекомбинантных белков, отобранных из числа M1_SF370 поверхности подвергаются белки и антитела были проверены на их способность связывать весь бактерий. All but seven sera were positive in the assay, confirming surface exposure of the proteins ( Fig. 1 and Supplementary Table 1 online). Все, кроме семи сыворотки были положительными в тесте, подтверждающий поверхностного воздействия на белки (рис. 1 и таблица 1 Дополнительная сети). For the remaining 21 proteins for which antisera were not available, we expect that a similar proportion would also be FACS positive. Для остальных 21 белков, для которых антисывороток не были представлены, мы ожидаем, что аналогичная доля будет также СУИМ положительным. Furthermore, several of the proteins appeared well expressed/exposed on the surface, as judged by fluorescent intensity, which, in some cases, was in the same range as that observed with the major surface antigen, the M protein 29 . Кроме того, некоторые белки, как хорошо выразил / выставлена на поверхность, а судить по флуоресцентной интенсивности, которая в некоторых случаях, в том же диапазоне, что и наблюдается с основными поверхности антиген, М протеин 29.

In conclusion, considering that (i) all proteins identified have a highly significant MASCOT score ( Supplementary Table 1 online), (ii) a large proportion of the 72 proteins is compatible with the corresponding PSORT-predicted localization and topology and (iii) a good match exists between the mass spectrometry data and the FACS data, we believe that the method leads to a reliable list of surface-exposed proteins. В заключение, учитывая, что (я) все выявленные белки имеют весьма важное значение MASCOT баллов (Таблица 1 Дополнительная онлайн), (II), значительная часть из 72 белков, совместимый с соответствующей PSORT-предсказал локализации и топологии и (III) хорошее соответствие между данными масс-спектрометрии и СУИМ данных, мы считаем, что этот метод приводит к надежным список поверхности подвергаются белки. Obviously, we cannot rule out that some of the identified proteins may represent experimental artifacts. Очевидно, что мы не можем исключать, что некоторые из указанных белков может представлять экспериментальные артефакты. In this respect, we have listed the proteins on the basis of the likelihood of being truly exposed on the surface ( Supplementary Table 2 online). В этой связи мы перечислили белки на основе вероятности быть действительно выставлена на поверхность (Дополнительный Таблица 2 сети). The highest probability score can be assigned to 52 proteins in that they were either confirmed by FACS analysis (44 proteins) or, despite the fact that FACS data were not available (5 proteins) or were negative (3 proteins), were identified with more than one peptide. Самая высокая оценка вероятности может быть назначено до 52 белков, в том, что они либо были подтверждены СУИМ анализ (44 белков), либо, несмотря на тот факт, что СУИМ данные не были доступны (5 белков), либо были отрицательными (3 белки), были выявлены более чем одного пептида.

Application to vaccine discovery Применительно к открытию вакцины
From our previous experience with Meningococcus B and group B Streptococcus we know that protective antigens must be well expressed and exposed on the surface of the bacterial cell 8, 9 . Из нашего предыдущего опыта менингококка группы B и B Streptococcus мы знаем, что защитные антигены должны быть четко выражена и воздействию на поверхности бактериальных клеток 8, 9. Hence, the comprehensive analysis of surface-exposed proteins may be an ideal approach to the identification of vaccine candidates. Таким образом, комплексный анализ поверхности подвергаются белки могут быть идеальный подход к выявлению вакцин. In support of this, 7 of the 11 reported GAS protective antigens 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 whose genes are present in M1_SF370 are part of the M1_SF370 surface proteome ( Table 1 ). В подтверждение этого, 7 из 11 сообщили, ГАЗ защитных антигенов, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, чьи гены присутствуют в M1_SF370 являются частью M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА ( Таблица 1). We therefore decided to investigate whether proteins identified here could elicit protective responses in a mouse model of infection and disease. Поэтому мы решили исследовать белки выявлены ли здесь можно было получить ответы на защитные мышь Модель инфекции и болезни. To this end, we analyzed the complete set of surface-exposed proteins of M23_DSM2071, a GAS strain that, unlike M1_SF370, is highly virulent in mice. С этой целью мы проанализировали комплект поверхности подвергаются белки M23_DSM2071, ГАЗ напряжения, что, в отличие от M1_SF370, очень вирулентного у мышей. It should be noted that, because the genome sequence of M23_DSM2071 is not available, only the proteins whose genes are shared with M1_SF370 or any of the other six GAS strains whose sequences are available in the public databases ( http://www.tigr.org/ and http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) could be identified. Следует отметить, что, поскольку геном последовательность M23_DSM2071 не имеется, только белки, гены, которые являются общими с M1_SF370 или любой из других шести ГАЗ штаммы которых последовательностей имеются в государственных базах данных (http://www.tigr. Org / и http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), могут быть идентифицированы. Furthermore, in contrast to M1_SF370, M23_DSM2071 produces a robust amount of capsule (data not shown), which is expected to limit the number of proteins readily accessible to protease action. Кроме того, в отличие от M1_SF370, M23_DSM2071 производит надежные размере капсулы (данные не показаны), который, как ожидается, ограничить количество белков, легко доступных для протеазы действий. A total of 17 proteins were unambiguously identified: 5 cell wall–anchored proteins, 4 lipoproteins, 5 membrane proteins, 2 secreted proteins and 1 cytoplasmic protein ( Table 2 ). В общей сложности из 17 белков были однозначно определены: 5-клеточной стенки закреплена белков, липопротеидов 4, 5 мембранные белки, протеины секретированный 2 и 1 цитоплазматической белка (табл. 2). All of the identified proteins have a homolog in M1_SF370 and all but two (the putative zinc-containing alcohol dehydrogenase and the putative, RofA-related, regulatory protein) were also included in the M1_SF370 surface proteome ( Supplementary Table 1 online). Все выявленные белки имеют homolog в M1_SF370 и все, за исключением двух (мнимых цинк-содержащих алкоголь дегидрогеназа и мнимых, RofA связаны регулирования белка), были также включены в M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА (дополнительные таблицы 1 в сети). Of the 17 proteins specific to M23_DSM2071, 14 proteins were successfully expressed in Escherichia coli as either soluble histidine-fusions or glutathione S -transferase (GST)-fusions ( Table 2 ). Из 17 белков, характерных для M23_DSM2071, 14 белков были успешно выразил в кишечной палочки в виде растворимых гистидин-слияний и глутатион S-трансферазы (GST)-слияний (Таблица 2). Each recombinant protein was used to immunize mice intraperitoneally and the mice were subsequently challenged intranasally with an LD 90 dose (10 6 colony forming units (CFUs) in 50 Каждый рекомбинантного белка была использована для иммунизации мышам внутрибрюшинно и мышами впоследствии были оспорены intranasally с доза ЛД 90 (10 6 колонии формирование подразделений (CFUs) в 50 l) of M23_DSM2071 (LD 90 is defined as the dose that kills 90% of the challenged mice). л) от M23_DSM2071 (LD 90 считается доза, которая убивает 90% оспорило мышей). Two proteins were protective in this model: the M protein (90% survival rate) and Spy0416 (70% survival rate) ( Table 3 ). Две защитные белки были в этой модели: М протеин (90% выживаемости) и Spy0416 (70% выживаемости) (Таблица 3). Spy0416 is a putative cell envelope proteinase carrying a typical cell wall–anchoring LPXTG motif, whose protective activity has never been reported before. Spy0416 является предполагаемый клеток конверт протеиназ перевозящие типичные клеточной стенки-якорь LPXTG мотив, чья защитная деятельность никогда не было сообщено ранее.


Table 1. List of reported group A Streptococcus protective antigens and their identification in the M1_SF370 surface proteome Таблица 1. Список зарегистрированных группы Streptococcus защитных антигенов и их идентификации в M1_SF370 поверхностных ПРОТЕОМА



Full Table Полная таблица



Table 2. Surface proteome of group A Streptococcus M23_DSM2071 strain and comparison with the M1_SF370 surface proteome Таблица 2. Поверхность ПРОТЕОМА группы Streptococcus M23_DSM2071 деформации и сравнение с M1_SF370 поверхность ПРОТЕОМА



Full Table Полная таблица



Table 3. Protective activity of Spy0416 Таблица 3. Защитные деятельности Spy0416



Full Table Полная таблица


Top Верх



Discussion Обсуждение
In silico analysis of the complete sequence of >100 bacterial genomes predicts that surface-associated proteins constitute between 30% and 40% of all bacterial proteins. В silico анализ полной последовательности> 100 бактериальных геномов, предсказывает, что поверхностно-ассоциированных белков составляют от 30% до 40% всех бактериальных белков. A considerable proportion of these proteins are poorly characterized in terms of function, level and kinetics of expression, and topology. Значительная часть этих белков плохо с точки зрения функций, уровня и кинетика выражения и топологии. Surface proteins of several bacteria have been analyzed using a variety of proteomic approaches. Поверхностные белки некоторых бактерий, были проанализированы с использованием разнообразных протеомических подходов. However, reliable methods capable of providing detailed pictures of surface protein organization in bacteria are still unavailable. Вместе с тем, надежных методов, способных оказать подробные фотографии поверхности белка организации бактерий по-прежнему недоступна. Particularly challenging has been the identification of the pools of proteins that extend beyond the cell wall and polysaccharide capsule and constitute a subgroup of membrane proteins that are expected to play key roles in communicating and interacting with the environment. Особенно сложным было определение бассейны белков, которые выходят за стены клеток и полисахаридов капсулы и представляют собой подгруппу мембранных белков, которые, как предполагается, играют ключевую роль в общении и взаимодействии с окружающей средой. Moreover, in pathogenic bacteria these proteins are the most promising vaccine candidates, as we also have recently demonstrated 8, 9 . Кроме того, патогенные бактерии, эти белки являются наиболее перспективных вакцин-кандидатов, а также недавно продемонстрировали 8, 9.

GAS is responsible for a variety of clinical syndromes, ranging from uncomplicated pharyngitis and impetigo to pneumonia, sepsis, necrotizing fasciitis and streptococcal toxic shock syndrome. ГАЗ отвечает за целый ряд клинических синдромов, от незатрудненного фарингита и импетиго на пневмонию, сепсис, некротический фасцит и стрептококковый синдрома токсического шока. Furthermore, untreated streptococcal pharyngitis and skin infections may lead to acute rheumatic fever, chronic rheumatic heart disease and acute glomerulonephritis 42 . Кроме того, неочищенные стрептококковый фарингит и кожные инфекции может привести к острой ревматической атаки, хронические ревматические болезни сердца и острый гломерулонефрит 42. Despite the importance of this pathogen, to the best of our knowledge, the systematic analysis of its surface antigens is limited to one publication 43 in which the authors analyzed mutanolysin cell wall extracts of three different GAS strains by a combination of 2D gel/mass spectrometry analysis and immunoblots with human sera. Несмотря на важность этого патогена, насколько нам известно, систематический анализ ее поверхностных антигенов ограничивается одной публикации 43, в которой авторы проанализировали mutanolysin клеточной стенки экстрактов трех различных штаммов ГАЗ на сочетание 2D гель / масс-спектрометрии анализ и immunoblots с человеческой сыворотки. The drawback of this approach is that digestion of the peptidoglycan cell wall increases susceptibility to lysis and release of cytoplasmic proteins. Недостаток такого подхода заключается в том, что пищеварение в peptidoglycan клеточной стенки увеличивается восприимчивость к лизис и высвобождение цитоплазматических белков. In fact, of the 74 proteins identified in these experiments, 75% were predicted to be cytoplasmic and less than 25% were experimentally demonstrated to be on the surface. В самом деле, из 74 протеинов, выявленных в этих экспериментах, 75% из них были по прогнозам, будет цитоплазматической и менее чем на 25% было экспериментально доказано, что на поверхности.

The approach described here provides the most extensive and detailed map of the surface-exposed antigens of a GAS isolate to date. Подход, описанный здесь, представляет собой наиболее обширную и подробную карту поверхности дозы антигена ГАЗ выделить на сегодняшний день. Of the 72 surface-exposed proteins identified in the M1_SF370 strain, 95% were predicted to belong to the categories of cell wall–anchored proteins, lipoproteins, transmembrane-spanning proteins and secreted proteins. Из 72 поверхностных белков подвергаются определенным в M1_SF370 деформации, 95% из них были прогнозам относятся к категории клеточной стенке закреплена-белков, липопротеидов, трансмембранный охватывающие белки и белки секретированный. Genome analysis predicts that the numbers of GAS M1_SF370 proteins constituting these protein families are 17, 28, 561 and 83, respectively ( Fig. 1 ). Геном анализ предсказывает, что число ГАЗ M1_SF370 этих белков, составляющих белка семей 17, 28, 561 и 83, соответственно (рис. 1). Therefore, although a large proportion of all predicted cell wall–anchored proteins and lipoproteins were identified (70% and 40%, respectively), only a small fraction (6.5%) of these were transmembrane proteins. Таким образом, хотя значительная доля всех предсказал-клеточной стенки закреплена белков и липопротеидов были выявлены (70% и 40% соответственно), лишь небольшая часть (6,5%) из них были трансмембранный белков. This indicates that the majority of these proteins are deeply embedded in the membrane and/or hidden by cell wall components, are poorly expressed or both. Это свидетельствует о том, что большинство из этих белков глубоко встроенных в мембраны и / или скрыты компоненты клеточной стенки, слабо выраженные или обоих. Although we cannot rule out that some membrane-associated proteins were not identified because they are either too resistant or too sensitive to protease digestion, we believe that the number of false-negative proteins is limited. Хотя мы не можем исключать, что некоторые мембранных белков, связанных не были определены, поскольку они являются либо слишком устойчивы или слишком чувствительны к протеазы пищеварение, мы считаем, что количество ложных отрицательных белков ограничено. First, most of the cell wall proteins and lipoproteins, which are designed to extend out of the membrane, were identified, whereas very few secreted proteins were identified; this is in keeping with the notion that only a minor fraction of secreted proteins remain associated with the bacteria. Во-первых, большая часть клеточной стенки белков и липопротеидов, которые призваны расширить из мембраны, были определены, в то время очень мало выделяется белков было выявлено, что в соответствии с тем, что лишь незначительная часть выделяется белки остаются связанными с бактерии. Second, no biochemical or structural reasons are known that make membrane proteins either more sensitive or more resistant to protease treatment than the cell wall proteins and lipoproteins are. Во-вторых, нет биохимических или структурных причин, как известно, что мембранные белки делать либо более чувствительны и более устойчивы к лечению, чем протеазы клеточной стенки белков и липопротеидов являются. Moreover, we have recently described the presence of pili in GAS and we have shown that pili correspond to the trypsin-resistant T antigens described by Lancefield and used for serotyping of GAS isolates 30 . Кроме того, мы недавно описал присутствие Пили в газе и мы показали, что Пили соответствуют трипсин устойчивостью T антигенов описывается Lancefield и используется для serotyping газа изолятах 30. Despite their trypsin-resistant nature, thanks to the use of more than one protease in the shaving step, the pilin proteins (NT01SP0102 and Spy0128) were part of the surface proteome ( Supplementary Table 1 online). Несмотря на их трипсин устойчивый характер, благодаря использованию более одного протеазы в бритвенный шаг, pilin белки (NT01SP0102 и Spy0128) были частью поверхности ПРОТЕОМА (Таблица 1 Дополнительные сети). Therefore, even the most recalcitrant proteins could be identified. Поэтому, даже самые непокорные белков могут быть выявлены.

Several membrane proteins are known to be shielded by other surface-exposed protein complexes and, in the case of capsulated bacteria, by the polysaccharide capsule that surrounds the bacterial cells. Несколько мембранных белков, как известно, экранированный другие поверхности подвергаются белковые комплексы, и, в случае capsulated бактерий путем полисахаридной капсула, которая окружает бактериальной клетки. In line with this, M23_DSM2071, a strain which produces more capsule than M1_SF370, was found to contain a relatively small number of surface-exposed proteins (17) compared to the 72 proteins of M1_SF370. В соответствии с этим, M23_DSM2071, штамм, который производит больше, чем капсулы M1_SF370, было установлено, содержат относительно небольшое количество поверхности подвергаются белки (17) по сравнению с 72 белков M1_SF370. Furthermore, we have recently found that M3_CDCSS-90, a highly virulent strain that, when grown in liquid culture, has three times as much capsular polysaccharide as M1_SF370 (data not shown), contained only ten major surface-exposed proteins ( Supplementary Table 3 online). Кроме того, недавно мы обнаружили, что M3_CDCSS-90, весьма вирулентных штаммов, что, когда выросли в жидкой культурой, имеет в три раза больше капсульные полисахаридной как M1_SF370 (данные не показаны), которые содержатся только в десяти крупных поверхности подвергаются белки (Дополнительный Таблица 3 сети). Although the genome sequences of both M3_CDCSS-90 and M23_DSM2071 are not available and therefore a few proteolytic peptides could not have been identified because of the sequence variation and gene variability within strains, overall our data indicate that the capsule plays a role in determining the extent of protein accessibility on the bacterial surface. Несмотря на то, что последовательность генома, так M3_CDCSS-90 и M23_DSM2071 не доступны, и поэтому несколько протеолитических пептидов не могли быть выявлены в результате вариаций последовательности генов и изменчивость в штаммы, в целом наши данные свидетельствуют о том, что капсула играет роль в определении степени белка доступность по бактериальной поверхности. This is consistent with what we have recently demonstrated for a group B Streptococcus protein, which was only accessible to antibody recognition in a capsule-negative mutant, and not in the parental wild-type encapsulated strain 9 . Это согласуется с тем, что мы недавно продемонстрировали в группе B Streptococcus белка, которая была доступна только на антитела к признанию в капсуле-негативного мутанта, а не на родителей дикого штамма инкапсулированные 9.

An important aspect of the approach proposed here is its utility in refining the protein topology derived from computer-assisted predictors such as PSORT. Важным аспектом предлагаемого подхода заключается в его полезность уточнения топологии белка, полученных из компьютера с помощью предсказателей, таких, как PSORT. Because the procedure selectively identifies peptides proteolytically generated from surface-exposed domains, by matching the topology prediction with peptide data, one can either confirm or refine the membrane organization of each identified protein. Поскольку процедура избирательно определяются пептидов proteolytically полученные от поверхности подвергаются областях, в соответствие с топологией прогнозирования пептид данные можно либо подтвердить или уточнить мембраны организации каждому из выявленных белка. In general, we found a good correlation between theoretical and experimental data. В общем, мы нашли хорошую корреляцию между теоретическими и экспериментальными данными. However, the topology of 30% of the transmembrane proteins identified did not fit with peptide data. Вместе с топологией 30% белков трансмембранный определил не соответствуют пептид данных. Manual inspection of each transmembrane protein highlighted the difficulty that algorithms such as PSORT encounter in assigning topological organization of proteins carrying transmembrane regions with low probability scores. Ручная проверка каждой трансмембранного белка подчеркнул, что сложность алгоритмов, таких, как PSORT столкнуться в присвоении Топологический организации белков, перевозящих трансмембранный регионах с низкой вероятностью очков. In this respect, the procedure could be successfully used in future refinements of current algorithms. В связи с этим процедуры могут быть успешно использованы в будущем уточнений существующих алгоритмов.

The search for effective vaccines to prevent group A streptococcal infections has been ongoing for many decades. Поиск эффективных вакцин для предотвращения стрептококкового группу инфекций была постоянной в течение многих десятилетий. Based on the original observation by Lancefield 44 that protection against GAS correlates in humans with the levels of bactericidal antibodies, the search for vaccine candidates has been focused on surface antigens. Основываясь на оригинальной замечание Lancefield 44 о том, что защита от ГАЗ соотносится у людей с уровнем антител бактерицидно, поиски вакцины кандидатов была сосредоточена на поверхности антигены. Indeed, the most promising vaccine candidate so far described is the surface M protein, which is a primary virulence determinant and which is used for GAS serotyping 45 . Действительно, наиболее перспективным кандидатом вакцины до сих пор описанных является поверхности М протеин, который является одним из основных факторов, определяющих вирулентность, и который используется для ГАЗ serotyping 45. However, the M protein is a highly variable antigen such that GAS is currently classified in more than 100 different serotypes. Тем не менее, М белка высоко переменная антиген таким образом, чтобы газ в настоящее время классифицируются в более чем 100 различных серотипов. Therefore, although vaccine studies based on M protein are well underway 2, 46 , the identification of other, more conserved protective surface antigens would be highly desirable. Поэтому, хотя исследования вакцин основано на М белка хорошо по 2, 46, выявление других, более сохранение защитных поверхностных антигенов бы весьма желательным. A relevant result from our work is the demonstration that comprehensive characterization of surface-exposed proteins can lead to new vaccine candidate discovery. Соответствующим результатом нашей работы является демонстрацией, что всесторонняя характеристика поверхности подвергаются белки могут привести к новой вакцине кандидата открытий. Among the 14 identified surface proteins tested, one protein, Spy0416, conferred high protection levels. Из 14 выявленных поверхностных белков испытания, один белок, Spy0416, присудил высокие уровни защиты. This is a remarkable result, considering the paucity of protective antigens that have been identified to date. Это замечательный результат, учитывая скудость защитных антигенов, которые были определены на сегодняшний день. Spy0416 is a 1,647 amino acid cell wall protein, which shares 48% similarity with the C5a peptidase precursor and has a calcium-dependent serine protease activity 47 . Spy0416 является 1647 аминокислот белка клеточной стенки, которая разделяет 48% сходства с C5a peptidase прекурсоров и кальций-зависимых протеаз серин деятельности 47. Spy0416 has a homolog in group B Streptococcus (cspA) that was proposed to be involved in virulence by potentially protecting the bacterium from opsonophagocytic killing 48 . Spy0416 имеет homolog в группе B Streptococcus (cspA), что было предложено принять участие в вирулентности потенциально защитить бактерии от opsonophagocytic убив 48. Interestingly, Lei and coworkers recently found that a 31-kDa, N-terminal fragment of Spy0416 is released in the supernatant of GAS cultures and that the protein is well recognized by sera from GAS-infected patients 49 . Интересно, лей и коллегами недавно обнаружил, что 31-кДа, N-концевой фрагмент Spy0416 выпущена в супернатант ГАЗ культуры и что белков хорошо признана сывороток от ГАЗ-инфицированных пациентов, 49. Based on the seven available genome sequences, the protein appears to be highly conserved (over 98% identity) and preliminary data on surface expression on a panel of 20 different GAS strains indicate that Spy0416 is a major component of over 70% of circulating strains (SC and GB, unpublished data). Исходя из семи имеющихся последовательностей генома, белково-видимому, сохраняется высокой (свыше 98% личности), и предварительные данные о поверхности выражение Группа ГАЗ 20 различных штаммов Spy0416 указывают на то, что является важным компонентом более 70% циркулирующих штаммов ( SC и ГБ, неопубликованные данные).

Top Верх



Methods Методы
Bacterial surface digestion. Бактериальные поверхности пищеварение.
Streptococcus pyogenes M1_SF370, M3_CDCSS-90 and M23_DSM2071 (DSMZ) were grown in Todd-Hewitt broth (THB) at 37 °C and 5% CO 2 , until an OD 600 of 0.4 (exponential phase) was reached. Streptococcus pyogenes M1_SF370, M3_CDCSS-90 и M23_DSM2071 (DSMZ) были выращены в Тодд-хьюиттовские бульоне (THB) при 37 ° С и 5% CO 2, до тех пор, пока ОД 600 0.4 (экспоненциальной фазе) была достигнута. Bacteria were harvested by centrifugation at 3,500 g for 10 min at 4 °C, and washed three times with PBS. Бактерии были заготавливаемым путем центрифугирования в 3500 г в течение 10 мин при 4 ° C, и три раза промывают с PBS. Cells were resuspended in one-hundredth volume of PBS containing 40% sucrose (pH 7.4 for trypsin digestion and pH 6.0 for proteinase K digestion). Клетки были resuspended в одной сотой объема PBS, содержащий 40% сахарозы (рН 7.4 для трипсин пищеварение и рН 6.0 для протеиназы К пищеварения). Digestions were carried out with 20 Digestions были проведены с 20 g trypsin (Promega) or 5 г трипсина (Promega) или 5 g proteinase K (Sigma) in the presence of 5 mM DTT, for 30 min at 37 °C. г протеиназы К (Sigma), в присутствии 5 мМ DTT, в течение 30 мин при 37 ° C. The digestion mixtures were centrifuged at 3,500 g for 10 min at 4 °C, and the supernatants (containing the peptides) were filtered using 0.22- Сбраживание смеси центрифугировали в 3500 г в течение 10 мин при 4 ° C, и supernatants (содержащий пептиды) были отфильтрованы с помощью 0.22 - m pore-size filters (Millipore) . м поровое размер фильтров (Millipore). Protease reactions were stopped with formic acid at 0.1% final concentration. Протеазы реакции были остановлены с муравьиной кислоты на 0,1% окончательный концентрации. Before analysis, salts were removed by off-line high-performance liquid chromatography (HPLC), with a 7-min gradient of 2–80% acetonitrile in 0.1% formic acid. Перед анализом, соли были удалены оффлайн высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), с 7-мин градиентом 2-80% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоты. Peptide fractions were concentrated with a Speed-vac centrifuge (Savant) , and kept at -20 °C until further analysis. Пептидов фракции были сконцентрированы с Speed-VAC центрифуг (Savant), и хранится при температуре -20 ° C до дальнейшего анализа.

Protein identification technology by nano-LC/MS/MS. Белки определение технологии nano-LC/MS/MS.
Two different platforms were used for the chromatographic separation of peptides and further identification by tandem mass spectrometry (MS/MS). Два разных платформах используются для хроматографического разделения пептидов и дальнейшее выявление тандем масс-спектрометрия (MS / MS). In the first, peptides were separated by 2-D-nano-liquid chromatography (LC; Dionex). Во-первых, пептиды были разделены на 2-D-нано-жидкостной хроматографии (LC; Dionex). In the first dimension, peptides were loaded on a strong cation exchange (SCX) column (10 cm В первом измерении, пептиды были погружены на сильные катионообменной (SCX) колонки (10 см 320 320 m inner diameter (id), packed with cross-linked particles functionalized with sulfoethyl groups) and eluted isocratically by applying five NaCl solutions of increasing concentrations (0.01, 0.05, 0.1, 0.5 and 1 M). м внутренний диаметр (ID), упакованные в сшитых частиц функционализированных с sulfoethyl групп) и eluted isocratically путем применения пяти NaCl решений увеличения концентрации (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 и 1 м). In the second dimension, peptides were separated by a reversed-phase C18 analytical column (15 cm Во второй аспект, пептиды были разделены вспять этапа C18 аналитические колонки (15 см 75 75 m id, C18 PepMap100, 3 м ID, C18 PepMap100, 3 m, 100 Å) through a C18 trap column (PepMap C18 м, 100 а) C18 ловушку колонка (PepMap C18 -precolumn, 300 -precolumn, 300 m id м ID 1 mm). 1 мм). Peptides were eluted with a 45-min gradient of 5–50% of 80% acetonitrile in 0.1% formic acid at a flow rate of 300 nl/min. Пептиды были eluted с 45-минутной градиентом 5-50% до 80% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоты на скорость потока 300 NL / мин. Eluates were continuously spotted onto an Anchor-Chip matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) target (Bruker Daltoniks), prepared with a thin layer of a saturated solution of Eluates постоянно заметили на Якорь Чип-матрицы с помощью лазерной десорбции ионизации (MALDI) целевая (Bruker Daltoniks), подготовленный с тонким слоем насыщенного решения -cyano-4-hydroxycynnamic acid in acetone, every 60 s using a Proteineer FC robot (Bruker Daltoniks). -циано-4-hydroxycynnamic кислоты в ацетоне, каждые 60 сек, используя Proteineer ФК робот (Bruker Daltoniks). After fraction collection, every spot was manually recrystallized with 0.6 После фракция коллекции, каждые месте был вручную recrystallized с 0,6 l of ethanol/acetone/0.1% trifluoroacetic acid (6:3:1). л ethanol/acetone/0.1% трифторуксусной кислоты (6:3:1). Mass spectrometry analysis was performed automatically with an Ultraflex MALDI-time-of-flight (TOF) instrument, under the control of the WARP LC software, version 1.0 (Bruker Daltoniks). Масс-спектрометрия анализ производится автоматически при Ultraflex MALDI-время-от-рейс (TOF) документа, под контролем WARP LC программного обеспечения, версия 1.0 (Bruker Daltoniks). First, MS spectra of all the spotted fractions were acquired for peak selection over the m/z range of 900–4,000, after which MS/MS spectra of selected peaks were obtained. Во-первых, MS спектры всех пятнистых фракций были приобретены на пик отбора более м / Z диапазоне 900-4000, после чего MS / MS спектры отдельных пиков были получены. After spectra acquisition, the individual MS/MS spectra acquired for each of the precursor ions were combined, smoothed and centroided using FlexAnalysis software, version 2.4 (Bruker Daltoniks), and then transferred to BioTools software, version 3.0 (Bruker Daltoniks) to create a batch .xml file containing the peak lists of any of the individual MS/MS spectra. После приобретения спектров, индивидуальный MS / MS спектрам приобрел для каждого из прекурсоров ионов были объединены, и сглаженный centroided использованием FlexAnalysis программного обеспечения, версия 2.4 (Bruker Daltoniks), а затем перевели в BioTools программного обеспечения, версия 3.0 (Bruker Daltoniks), чтобы создать партии. XML-файл, содержащий пик списках какой-либо из отдельных MS / MS-спектров. Search and identification of peptides were performed in batch mode with a licensed version of MASCOT, in a local database containing the 1,819 proteins derived from the complete genome sequences of S. Поиск и идентификация пептидов были выполнены в пакетном режиме с лицензированной версии MASCOT, в локальной базе данных, содержащей 1819 белков, полученных от полной последовательности генома С. pyogenes (downloaded from http://www.tigr.org/ and http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ). pyogenes (скачать с http://www.tigr.org/ и http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The MASCOT search parameters were (i) species, S. MASCOT поиска параметров (I) видов, С. pyogenes strain SF370; (ii) allowed number of missed cleavages (only for trypsin digestion), 6; (iii) variable post-translational modifications, methionine oxidation; (iv) peptide tolerance, pyogenes штамма SF370; (II) позволили число пропущенных раскол (только для трипсин пищеварение), 6 (III) переменной пост-трансляционной модификации, метионин окисления (IV) пептид терпимости, 100 ppm; (v) MS/MS tolerance, 100 частей на миллион; (V), MS / MS терпимости, 0.75 Da and (vi) peptide charge, +1. 0,75 Да и (VI) пептид заряд, 1. Only significant hits as defined by MASCOT probability analysis were considered. Единственное существенное хиты, как это определено MASCOT вероятность анализа были рассмотрены. The score thresholds for acceptance of protein identifications from at least one peptide were set by MASCOT as 18 for trypsin digestion and 36 for proteinase K digestion. Оценка пороговых уровней для принятия идентификации белка по крайней мере одного пептида были установлены в качестве MASCOT 18 трипсин пищеварение и 36 для протеиназы К пищеварение.

In the second platform, peptides were separated by nano-LC on a CapLC HPLC system (Waters) connected to a Q-ToF Micro Electron Spray Ionization (ESI) mass spectrometer equipped with a nanospray source (Waters). Во второй платформы, пептиды были разделены нано-LC на CapLC ВЭЖХ системы (Вода), подключенной к Q-TOF Micro Electron Брызгатель ионизации (ESI) масс-спектрометр, оснащенных nanospray источников (воды). Samples were loaded onto an Atlantis C18 NanoEase column (100 Пробы были погружены на Атлантис C18 NanoEase колонке (100 m id м ID 100 mm, Waters), through a C18 trap column (300 100 мм, воды), через C18 ловушка колонке (300 m id м ID 5 mm, Dionex). 5 мм, Dionex). Peptides were eluted with a 50-min gradient of 2–60% of 95% acetonitrile, in a solution of 0.1% formic acid at a flow rate of 400 nl/min. Пептиды были eluted с 50-минутной градиентом 2-60% от 95% ацетонитрила в растворе 0,1% муравьиной кислоты на скорость потока 400 NL / мин. The eluted peptides were subjected to an automated data-dependent acquisition program, using the MassLynx software , version 4.0 (Waters), where a MS survey scan was used to automatically select multicharged peptides over the m/z range of 400–2,000 for further MS/MS fragmentation. Eluted пептиды подвергаются автоматизированной данные, зависящие от приобретения программу, используя программное обеспечение MassLynx, версия 4.0 (Вода), в которых MS опроса сканирования используется для автоматического выбора многозарядный пептиды более м / Z диапазоне 400-2000 для дальнейшего MS / MS фрагментации. Up to three different components were subjected to MS/MS fragmentation at the same time. До трех различных компонентов, подвергались MS / MS фрагментации в то же время. For all the samples, a second nano-LC-MS/MS analysis was carried out for the selective fragmentation of mono-charged peptide species. Для всех образцов, второй nano-LC-MS/MS Анализ проводился на выборочной фрагментации моно-пептида заряженных видов. After data acquisition, the individual MS/MS spectra were combined, smoothed and centroided by MassLynx. После получения данных, отдельные MS / MS спектры были объединены, и сглаженный centroided по MassLynx. Search and identification of peptides were performed in batch mode with a licensed version of MASCOT, in a local database (see above), after converting the acquired MS/MS spectra in .pkl file. Поиск и идентификация пептидов были выполнены в пакетном режиме с лицензированной версии MASCOT в локальной базе данных (см. выше), после преобразования приобрели MS / MS спектров. PKL файл. The MASCOT search parameters were (i) species, S. MASCOT поиска параметров (I) видов, С. pyogenes genome sequences; (ii) allowed number of missed cleavages (only for trypsin digestion), 6; (iii) variable post-translational modifications, methionine oxidation; (iv) peptide tolerance, 500 ppm; (v) MS/MS tolerance, 0.3 Da and (vi) peptide charge, from +1 to +4. As for the previous platform, only significant hits as defined by MASCOT probability analysis were considered. The score thresholds for acceptance of protein identifications from at least one peptide were set by MASCOT as 18 for trypsin digestion and 36 for proteinase K digestion.

Expression and purification of GAS proteins and preparation of immune sera.
Cloning, expression and purification of recombinant proteins, and preparation of immune sera, were performed as described 9 . Briefly, the chromosomal DNA of M1_SF370 was used for gene amplification. PCR primers were designed so as to amplify genes without predicted signal-peptide coding sequences. PCR products were introduced into plasmid expression vectors so as to generate recombinant proteins fused either with 6-His or glutathione GST. His-tagged proteins were obtained by cloning in pET21b+ vectors (Novagen). E. coli BL21DE3 cells (Novagen) were used as the recipient. GST fusions were obtained by using pGEX-NN plasmids and E. coli BL21SI (Novagen) as the recipient. Affinity-purified proteins (three doses of 20 g/dose) were used to immunize groups of adult CD1 mice (six mice per group). Mice were bled 2 weeks after the third immunization. The sera of each group were pooled and stored at -80 °C.

Capsule quantification by colorimetric assay.
GAS strains were grown in 10 ml of THB and when the cultures reached an OD 600 of 0.4, cells were collected by centrifugation, washed twice with PBS and resuspended in 0.5 ml H 2 O. Hyaluronic acid polysaccharide was extracted twice by adding an equal volume of chloroform, and the organic phase was collected by centrifugation. For hyaluronic acid determination, 100 l of properly diluted organic phase were added to 1.9 ml of a solution containing 0.2% (wt/vol) Stains All Reagent (Sigma), 0.6% acetic acid and 50% formamide, and absorbance was measured at 640 nm and compared with the standard curve of hyaluronic acid experimentally defined using known amounts of polysaccharide.

FACS analysis of surface proteins.
Bacteria were grown in THB to an OD 600 of 0.4, washed twice with PBS, suspended in newborn calf serum ( NCS , Sigma), incubated for 20 min at 23 °C and dispensed into a 96-well (20 l/well). Eighty l of preimmune or immune mouse sera, diluted in PBS containing 0.1% BSA, was added to the bacterial suspension to a final dilution of 1:200 and incubated on ice for 30 min. After washing twice with 0.1% BSA in PBS, bacteria were incubated on ice for 30 min in 10 l of goat anti-mouse IgG , F(ab') 2 fragment-specific-R-phycoerythrin-conjugated (Jackson Immunoresearch Laboratories) diluted 100-fold in PBS containing 0.1% BSA, 20% NCS. After incubation, bacteria were washed with PBS/0.1% BSA, suspended in 200 l PBS and analyzed using a FACS Calibur cytometer (Becton Dickinson) and Cell Quest Software (Becton Dickinson) .

Screening of protective antigens in the mouse model.
Five-week-old female CD1 mice (ten mice/group) were immunized with 20 g of recombinant proteins administered intraperitoneally at 0, 21 and 35 d with complete Freund adjuvant (priming dose) and incomplete Freund adjuvant (booster doses). Blood samples were collected before the first and after the third immunizations. Immunized mice were challenged intranasally with 50 l of THB containing 10 6 CFUs of M23_DSM 2071 strain grown in THB broth at an OD 600 of 0.4. CFU number of the infecting dose was verified by plating on 5 TH plates supplemented with 0.5% yeast extract and 5% defibrinated sheep blood. After challenge, mice were controlled daily for survival and the final survival rate was calculated 10 d thereafter.

Note: Supplementary information is available on the Nature Biotechnology website .

Top



Received 10 August 2005; Accepted 18 November 2005; Published online: 15 January 2006.

REFERENCES
Lindahl, G. , Stalhammar-Carlemalm, M. & Areschoug, T. Surface proteins of Streptococcus agalactiae and related proteins in other bacterial pathogens. Clin. Microbiol. Rev. 18 , 102–127 (2005). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Courtney, HS , Dale, JB & Hasty, DL in Handbook of Bacterial Adhesion: Principles, Methods and Applications (eds. An, YN & Friedman, RJ) 553–579 (Human Press, Totowa, NJ, 2002).
Lin, J. , Huang, S. & Zhang, Q. Outer membrane proteins: key players for bacterial adaptation in host niches. Microbes Infect. 4 , 325–331 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Niemann, HH , Schubert, WD & Heinz, DW Adhesins and invasins of pathogenic bacteria: a structural view. Microbes Infect. 6 , 101–112 (2004). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Ton-That, H. , Marraffini, LA & Schneewind, O. Protein sorting to the cell wall envelope of Gram-positive bacteria. Biochim. Biophys. Acta 1694 , 269–278 (2004). | PubMed | ISI | ChemPort |
Janulczyk, R. & Rasmussen, M. Improved pattern for genome-based screening identifies novel cell wall–attached proteins in gram-positive bacteria. Infect. Immun. 69 , 4019–4026 (2001). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Galperin, MY & Koonin, EV Searching for drug targets in microbial genomes. Curr. Opin. Biotechnol. 10 , 571–578 (1999). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Pizza, M. et al . Identification of vaccine candidates against serogroup B meningococcus by whole-genome sequencing. Science 287 , 1816–1820 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Maione, D. et al . Identification of a universal group B Streptococcus vaccine by multiple genome screen. Science 309 , 148–150 (2005). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Nakai, K. Protein sorting signals and prediction of subcellular localization. Adv. Protein Chem. 54 , 277–344 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Doytchinova, IA , Taylor, P. & Flower, DR Proteomics in vaccinology and immunobiology: an informatics perspective of the immunone. J. Biomed. Biotechnol. 2003 , 267–290 (2003). | PubMed |
Molloy, MP et al . Proteomic analysis of the Escherichia coli outer membrane. Eur. J. Biochem. 267 , 2871–2881 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Phadke, ND et al . Analysis of the outer membrane proteome of Caulobacter crescentus by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics 1 , 705–720 (2001). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Molloy, MP et al . Profiling the alkaline membrane proteome of Caulobacter crescentus with two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics 2 , 899–910 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Nouwens, AS et al . Complementing genomics with proteomics: the membrane subproteome of Pseudomonas aeruginosa PAO1. Electrophoresis 21 , 3797–3809 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Rhomberg, TA et al . Proteomic analysis of the sarcosine-insoluble outer membrane fraction of the bacterial pathogen Bartonella henselae . Proteomics 4 , 3021–3033 (2004). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Sabarth, N. et al . Identification of surface proteins of Helicobacter pylori by selective biotinylation, affinity purification, and two-dimensional gel electrophoresis. J. Biol. Chem. 277 , 27896–27902 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Guina, T. et al . Proteomic analysis of Pseudomonas aeruginosa grown under magnesium limitation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14 , 742–751 (2003). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Ferretti, JJ et al . Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes . Proc. Natl Acad. Sci. USA 98 , 4658–4663 (2001). | Article | PubMed | ChemPort |
Marques, MA , Chitale, S. , Brennan, PJ & Pessolani, MC Mapping and identification of the major cell wall-associated components of Mycobacterium leprae . Infect. Immun. 66 , 2625–2631 (1998). | PubMed | ISI | ChemPort |
Dallo, SF , Kannan, TR , Blaylock, MW & Baseman, JB Elongation factor Tu and E1 beta subunit of pyruvate dehydrogenase complex act as fibronectin binding proteins in Mycoplasma pneumoniae . Mol. Microbiol. 46 , 1041–1051 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Spence, JM & Clark, VL Role of ribosomal protein L12 in gonococcal invasion of Hec1B cells. Infect. Immun. 68 , 5002–5010 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Kurar, E. & Splitter, GA Nucleic acid vaccination of Brucella abortus ribosomal L7/L12 gene elicits immune response. Vaccine 15 , 1851–1857 (1997). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Tomoyasu, T. et al . Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli . J. Bacteriol. 175 , 1352–1357 (1993). | PubMed | ISI | ChemPort |
Akiyama, Y. , Kihara, A. , Mori, H. , Ogura, T. & Ito, K. Roles of the periplasmic domain of Escherichia coli FtsH (HflB) in protein interactions and activity modulation. J. Biol. Chem. 273 , 22326–22333 (1998). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Amara, RR , Shanti, S. & Satchidanandam, V. Characterization of novel immunodominant antigens of Mycobacterium tuberculosis . Microbiology 144 , 1197–1203 (1998). | PubMed | ISI | ChemPort |
Padmalayam, I. , Anderson, B. , Kron, M. , Kelly, T. & Baumstark, B. The 75-kilodalton antigen of Bartonella bacilliformis is a structural homolog of the cell division protein FtsZ. J. Bacteriol. 179 , 4545–4552 (1997). | PubMed | ISI | ChemPort |
Paterson, GK & Mitchell, TJ The biology of Gram-positive sortase enzymes. Trends Microbiol. 12 , 89–95 (2004). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lancefield, RC Studies on the antigenic composition of group A hemolytic Streptococci . J. Exp. Med. 78 , 465–476 (1943). | Article | ChemPort |
Mora, M. et al . Group A Streptococcus produce pilus-like structures containing protective antigens and Lancefield T antigens. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102 , 15641–15646 (2005). | Article | PubMed | ChemPort |
Stalhammar-Carlemalm, M. , Areschoug, T. , Larsson, C. & Lindahl, G. The R28 protein of Streptococcus pyogenes is related to several group B streptococcal surface proteins, confers protective immunity and promotes binding to human epithelial cells. Mol. Microbiol. 33 , 208–219 (1999). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Reid, SD et al . Postgenomic analysis of four novel antigens of group A Streptococcus : growth phase-dependent gene transcription and human serologic response. J. Bacteriol. 184 , 6316–6324 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
McMillan, DJ et al . Identification and assessment of new vaccine candidates for group A streptococcal infections. Vaccine 22 , 2783–2790 (2004). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Ji, Y. , Carlson, B. , Kondagunta, A. & Cleary, PP Intranasal immunization with C5a peptidase prevents nasopharyngeal colonization of mice by the group A Streptococcus . Infect. Immun. 65 , 2080–2087 (1997). | PubMed | ISI | ChemPort |
Massell, BF , Michael, JG , Amezcua, J. & Siner, M. Secondary and apparent primary antibody responses after group A streptococcal vaccination of 21 children. Appl. Microbiol. 16 , 509–518 (1968). | PubMed | ISI | ChemPort |
Dale, JB , Chiang, EY , Liu, S. , Courtney, HS & Hasty, DL New protective antigen of group A Streptococci . J. Clin. Invest. 103 , 1261–1268 (1999). | PubMed | ISI | ChemPort |
Kawabata, S. et al . Systemic and mucosal immunizations with fibronectin-binding protein FBP54 induce protective immune responses against Streptococcus pyogenes challenge in mice. Infect. Immun. 69 , 924–930 (2001). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Guzman, CA , Talay, SR , Molinari, G. , Medina, E. & Chhatwal, GS Protective immune response against Streptococcus pyogenes in mice after intranasal vaccination with the fibronectin-binding protein SfbI. J. Infect. Dis. 179 , 901–906 (1999). | PubMed | ISI | ChemPort |
Kuo, CF et al . Role of streptococcal pyrogenic exotoxin B in the mouse model of group A streptococcal infection. Infect. Immun. 66 , 3931–3935 (1998). | PubMed | ISI | ChemPort |
Roggiani, M. et al . Toxoids of streptococcal pyrogenic exotoxin A are protective in rabbit models of streptococcal toxic shock syndrome. Infect. Immun. 68 , 5011–5017 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lei, B. , Liu, M. , Chesney, GL & Musser, JM Identification of new candidate vaccine antigens made by Streptococcus pyogenes : purification and characterization of 16 putative extracellular lipoproteins. J. Infect. Dis. 189 , 79–89 (2004). | PubMed | ISI | ChemPort |
Cunningham, MW Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin. Microbiol. Rev. 13 , 470–511 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Cole, JN et al . Surface analyses and immune reactivities of major cell wall–associated proteins of group A Streptococcus . Infect. Immun. 73 , 3137–3146 (2005). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lancefield, RC Persistence of type-specific antibodies in man following infection with group A streptococci. J. Exp. Med. 110 , 271–292 (1959). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lancefield, RC Current knowledge of type-specific M antigens of group A Streptococci . J. Immunol. 89 , 307–313 (1962). | PubMed | ISI | ChemPort |
Hu, MC et al . Immunogenicity of a 26-valent group A streptococcal vaccine. Infect. Immun. 70 , 2171–2177 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Fernandez-Espla, MD , Garault, P. , Monnet, V. & Rul, F. Streptococcus thermophilus cell wall–anchored proteinase: release, purification, and biochemical and genetic characterization. Appl. Environ. Microbiol. 66 , 4772–4778 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Harris, TO , Shelver, DW , Bohnsack, JF & Rubens, CE A novel streptococcal surface protease promotes virulence, resistance to opsonophagocytosis, and cleavage of human fibrinogen. J. Clin. Invest. 111 , 61–70 (2003). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lei, B. , Mackie, S. , Lukomski, S. & Musser, JM Identification and immunogenicity of group A Streptococcus culture supernatant proteins. Infect. Immun. 68 , 6807–6818 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Top