НАНОТЕХНОЛОГИИ В МЕДИЦИНЕ: УСПЕХИ И ПЕРСПЕКТИВЫ
По материалам беседы с Всеволодом Ткачуком

--------------------------------------------------------------------------------

Врачи научились вводить действующий ген взамен поврежденного внутрь живой клетки, а также наблюдать метаболизм различных веществ в режиме реального времени. Об этом нашему корреспонденту рассказывает академик РАН и РАМН, декан факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, доктор биологических наук, профессор Всеволод Арсеньевич Ткачук

--------------------------------------------------------------------------------

В последнее время нанотехнологии все активнее внедряются во многие сферы человеческой деятельности. Эта тенденция не обошла и медицину. Сегодня макромолекулы и искусственно приготовленные частицы применяются для диагностики, лечения различных заболеваний и восстановления поврежденных тканей. Новое направление получило название наномедицина. Немалых успехов в этой области достигли отечественные ученые.

Медикам область нано знакома давно. Многие изучаемые ими биологические объекты меньше микрометра. Например, пептиды имеют размер 1 нм, белки — от 10 до 100 нм. ДНК человеческой клетки в длину достигает 1,5 м, однако в «упакованном» состоянии ее поперечник составляет лишь 100 нм. Примерно такие размеры имеют антитела, вирусы, органеллы, а клетки и бактерии принадлежат уже микромиру. Для наглядности можно привести такое сравнение: если клетку увеличить до размеров озера, то белки, антитела, вирусы будут как мелкая рыба, плавающая в нем.

Магнитные наночастицы

Чтобы эффективно лечить заболевание, нужно уметь проводить его диагностику на самой ранней стадии. Для этих целей используются магнитные наночастицы, содержащие кристаллическое ядро из оксида железа. Подобная диагностика хороша тем, что в организме нет магнитных частиц, а присутствует железо, которое входит в состав гемоглобина и находится в виде отдельных ионов, практически не обладающих магнитными свойствами.

При введении в организм суспензии из магнитных наночастиц каждая из них, будучи инородным телом, захватывается макрофагом (специализированные защитные клетки, поглощающие бактерий и другие чужеродные вещества), который в результате становится «меченым». Поскольку переварить неорганическую частицу он не может, то продолжает двигаться вместе с ней дальше. Если где-то есть опухоль или протекает воспалительный процесс, макрофаги устремляются туда, чтобы бороться с инфекциями, вирусами, бактериями, и скапливаются там в течение определенного времени. Используя магнитно-резонансный томограф, можно легко обнаружить области повышенной концентрации магнитных наночастиц, и таким образом определить очаги воспаления на самой ранней стадии их возникновения.

визуализация микрососудов с помощью водорастворимых квантовых точек в коже мыши (глубина 100 мкм)

Квантовые точки

Рассмотрим небольшой кусочек полупроводника, в котором имеется одна «дырка», т.е. положительно заряженный ион. Если его размеры значительно больше микрона, то он ведет себя как обычный макрообъект. Находящийся в нем свободный электрон с небольшой энергией может соединиться с таким ионом за счет кулоновских сил, тем самым нейтрализуя его. При уменьшении кристаллика полупроводника до размеров порядка 100 нм или меньше происходит качественное изменение его физических свойств благодаря появлению квантовых эффектов. Электрон обладает волновыми свойствами, и поэтому он не может локализоваться в объеме пространства меньшем, чем длина его волны — для этого ему не хватит энергии. В результате получается нанообъект, получивший название «квантовой точки». Электрон, обладающий небольшой энергией, не может ни улететь от дырки, ни упасть на нее. Получается своеобразная потенциальная ямка, обладающая из-за малых размеров квантовыми свойствами, в которой электрон имеет определенный спектр энергетических уровней. Соответственно, вся эта система «дырка — электрон» также обладает определенным электромагнитным спектром и напоминает обычный атом, который также представляет собой потенциальную яму. Однако только свойства обычных атомов всегда остаются неизменными, а спектр излучения квантовой точки можно регулировать по своему усмотрению, меняя ее размеры. Неслучайно нобелевский лауреат Ж.И. Алферов назвал квантовые точки искусственными атомами, свойствами которых можно управлять.

Сегодня уже научились готовить «суспензию» из квантовых точек определенного размера, имеющих, например, зеленый или какой-нибудь другой удобный для проведения исследований цвет. Кроме того, химики могут «пришивать» к квантовым точкам такие молекулы, которые способны специфически связываться с нужными молекулами или частями небольших органических тел, находящихся внутри живого организма. При таком связывании размер и цвет точки изменяются. К квантовой точке можно «пришить» какое-нибудь антитело, которое затем свяжет белок, или вещество, могущее химически связываться с определенным фрагментом ДНК — геном. Биохимики научились прикреплять к наночастицам характерные молекулы-зонды, которые связываются с определенным куском ДНК, белком, сосудистой стенкой либо просто «болтаются» в крови или лимфе.

Все это используется, чтобы решить одну из основных проблем в диагностической медицине — проблему фона: обычно очень трудно отличить сигнал, идущий из исследуемого места в организме, от разнообразных шумов, генерируемых окружающими тканями. Здесь особая роль отведена использованию квантовых точек. Как оказалось, при обнаружении раковых клеток на самой ранней стадии заболевания сначала синтезируется молекула, которая связывается только со специфическим белком, вырабатываемым в патологической клетке. Затем эта молекула пришивается к квантовой точке, имеющей, например, красный цвет. Наблюдая за появлением этого цвета в организме, можно определить, где находится злокачественная опухоль с точностью до отдельных клеток. Во время экспериментов с мышами исследователи вводили в их хвост красные квантовые точки, связывающиеся с раковыми клетками щитовидной железы. В области этого органа происходило накопление точек, и регистрировался характерный красный цвет.

Суспензию из зеленых квантовых точек можно вводить и в сосуды. После того как они достаточно быстро и равномерно распределятся, через кожу будет видна разветвленная сеть кровотока в виде характерного изумрудного «кораллового деревца» (илл. слева). И если в каком-то месте поврежден маленький сосуд или капилляр, это будет заметно по небольшим разрывам в зеленой сетке сосудов. Такой сигнал совершенно отчетлив, и его ни с чем нельзя спутать, т.к. в тканях человеческого организма зеленого цвета нет.

НАНОМЕДИЦИНА
Применение макромолекул и наночастиц для диагностики и лечения болезней, а также репарации поврежденных тканей


Весь геном человека в одной капле

Ученые уже расшифровали структуру генома человека, состоящего из 30 тыс. генов. Это примерно 3 млрд нуклеотидов, играющих роль своеобразных букв при записи наследственной информации. Также известно, в какой части гигантской «книги ДНК» записан каждый ген. Большинство болезней спровоцированы «сбоями», вызванными мутациями в генах, поэтому при медицинском обследовании важно знать, есть ли у пациента врожденная предрасположенность к каким-либо заболеваниям, вызванная наследственными «ошибками» в ДНК.

В настоящее время это делается с помощью микрочипов. На каждом квадратном миллиметре такого устройства нанесено примерно 100 квантовых точек, к каждой из которых пришит свой зонд, способный специфически связываться с определенным фрагментом ДНК и таким образом тестировать ее.

Общий принцип тестирования следующий. Допустим, нужно выяснить, нет ли у человека предрасположенности к болезни Альцгеймера или к сердечной недостаточности. Для этого у него берется анализ крови и определяется, присутствует ли там ген, мутации которого вызывают данный недуг. Затем в лабораторных условиях синтезируется небольшой фрагмент ДНК размером, например, в сто нуклеотидов. При этом только в данном гене из всех 30 тыс. имеющихся существует такая последовательность. Фрагмент пришивается к квантовой точке и помещается в определенную ячейку на чипе, другой специфичный фрагмент пришивается к другой квантовой точке и вводится в следующую ячейку и т.д.

После того как на чип наносится капелька крови, происходит связывание пришитых к квантовым точкам зондов с определенными фрагментами ДНК. Далее с помощью компьютера, оснащенного микроскопом, «просматриваются» последовательно все ячейки. Если в каждой квантовой точке изменился цвет, значит, произошло связывание со всеми генами, которые тестирует данный микрочип, и у человека с ними все в порядке. Если же в какой-то ячейке цвет не изменился, значит, связывание там не произошло, и, следовательно, в соответствующем гене имеется «поломка», т.е. нарушение в последовательности нуклеотидов. После чего выясняется, в каком именно месте гена расположена поломка. Если она в том кусочке, который отвечает за болезнь Альцгеймера, то, значит, имеется предрасположенность к этому недугу.

Сейчас уже созданы микрочипы, в которых количество ячеек измеряется десятками тысяч, и в каждой — индикатор на определенный фрагмент человеческой ДНК. Они могут принадлежать одному гену или разным — в зависимости от поставленной задачи. Сегодня с помощью квантовых точек можно диагностировать не только наследственные заболевания, но также различные инфекции и т.д. Существует «специализация» чипов. Например, один сделан для всех сердечно-сосудистых заболеваний, второй — для эндокринных, третий — для онкологических. Чип с капелькой исследуемой крови кладут под микроскоп, специальная программа считывает все точки, информация обрабатывается на компьютере, и диагноз по данной болезни готов.

К сожалению, данная технология не позволяет провести полную генетическую диагностику человека. Наследственная информация, содержащаяся в ДНК, столь велика, что для этого потребуются миллионы специализированных микрочипов. Но если освоить технологию изготовления наночипов с размером ячейки около 100 нанометров или даже еще меньше, то можно будет увеличить его информативность в миллионы раз. Наночиповая технология позволит при использовании всего одного квадратного сантиметра произвести диагностику человека по всем генам и мутациям. Достаточно одной капли крови — и можно узнать все о генетическом здоровье человека. Ожидается, что уже в ближайшие годы будет сконструирован наночип, на который можно нанести весь геном человека.

ДЕНДРИМЕРЫ КАК ПЕРЕНОСЧИКИ ГЕНОВ

Доставка генов строго по адресу

ДНК имеет спиралевидную структуру и состоит из двух связанных друг с другом комплементарных нитей, представляющих собой последовательность четырех нуклеотидов, расположение которых определяет структуру синтезируемого белка. И если есть подмена хотя бы одного из нуклеотидов, то в молекуле белка появится какая-то «чужая» аминокислота. Как результат, белок не сможет правильно упаковываться и будет плохо выполнять свои функции. Например, при таком врожденном заболевании, как серповидноклеточная анемия, белок гемоглобина из-за незначительного изменения в аминокислотной последовательности теряет способность принимать нужную форму и поэтому не может переносить кислород. Эта болезнь неизлечима, и человек погибает. Другие нарушения в работе белка, вызванные наследственными ошибками в ДНК, как правило, менее опасны, но, тем не менее, также могут приводить со временем к различным хроническим заболеваниям. И если раньше врачи пытались вылечить сам недуг, то теперь стараются устранить его причину — помочь организму правильно синтезировать нужный белок. Появилось даже новое направление в медицине — генотерапия. И многие болезни, вызванные сбоем в генах, как наследственным, так и приобретенным, сегодня вылечиваются.

Как показали исследования, только определенное количество генов участвует в работе клетки в зависимости от ее специализации. Если в каком-нибудь гене нарушена последовательность нуклеотидов, то синтезируемый на ее основе белок не может полноценно выполнять свои функции, что приводит к нарушению обмена веществ со всеми вытекающими отсюда последствиями.

В последнее время научились вводить в клетку человека полноценный ген взамен поврежденного, что создает возможность синтезировать «нужный» белок. Основная проблема — точная адресная доставка гена внутрь данной клетки. Для ее решения используется естественная способность клетки — так называемый эндоцитоз, т.е. захватывание наружной мембраной различных небольших частиц и органических молекул с последующим их перевариванием. Это свойство используют вирусы: они проникают внутрь клетки и заставляют ее работать на себя.

Вирус состоит из ДНК или РНК, окруженных белковой оболочкой, и самостоятельно размножаться не может. Такой паразит обладает определенной программой: попадая в живую клетку, он нарушает ее работу, заставляя копировать самого себя в тысячах и миллионах экземплярах. Размноженные таким способом вирусы покидают разрушенную клетку, чтобы найти себе новую жертву.

А что если использовать «стратегию» вирусов для внедрения в клетку нужного гена? Оказалось, такое возможно.

При лечении заболевания сначала выясняется, не вызвано ли оно генетическими ошибками. И если да, то определяется, какой именно ген работает со сбоями. Затем синтезируется требуемый фрагмент ДНК, который всегда представляет собой полианион, так как в нем положительно заряженные нуклеотидные основания соединены друг с другом и спрятаны внутри скрученной молекулы, а отрицательно заряженные фосфатные группы обращены наружу. Для нейтрализации внешнего электрического заряда к гену добавляется соответствующий поликатион. Под действием межатомных сил вся эта сложная структура сворачивается в наношарик. Сверху такой шарик покрывается другим полианионом. Это делается для того, чтобы клетка при соприкосновении с ним проглотила его, что она обычно делает с вирусом. Внутри клетки оболочка шарика разрушается под действием пищеварительных ферментов. Освободившийся ген проникает в ядро (илл. вверху), где и начинает работать — включает внутриклеточные механизмы синтеза белка на своей матрице. Внедренный таким способом ген успевает проработать около двух недель, затем клетка все же распознает чужака и уничтожает его.

Оказалось, что у больных тромбофлебитом и диабетом в ногах происходит разрушение мелких кровеносных сосудов, снабжение клеток кислородом нарушается, они отмирают, образуя так называемые трофические язвы. Традиционные методы лечения, как правило, не помогают, т.к. вводимые для восстановления сосудов белки могут «работать» внутри организма не более получаса и за это время ничего не успевают сделать. Боли при трофических язвах столь сильные, что приходится ампутировать ноги. Некоторым из таких пациентов, находящихся на последней, наиболее тяжелой стадии заболевания, периодически вводят путем инъекции гены, отвечающие за синтез недостающих белков. Уже через два месяца тончайшая сеть кровеносных сосудов заметно восстанавливается, и трофические язвы уменьшаются.

НАНОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ БИОСЕНСОРЫ — КЛЮЧ К ИССЛЕДОВАНИЮ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ НА МОЛЕКУЛЯРНОМ УРОВНЕ


Нанороботы и наномоторы

Наиболее перспективное направление будущих исследований в наномедицине — создание нанороботов, которые станут играть роль своеобразных нанодокторов. Двигаясь по всему организму внутри мельчайших сосудов и внутри клеток, они будут устранять различные неисправности и производить чистку сосудов. Одна из основных проблем при создании таких устройств — изготовление наномоторов, с помощью которых нанороботы смогут перемещаться внутри тканей и внутри отдельной клетки. Для достижения таких целей достаточно научиться использовать внутриклеточный «транспорт».

Каждую клетку можно сравнить с огромным мегаполисом, в котором множество заводов по производству белка и других органических соединений связаны друг с другом сложнейшей сетью дорог — актиновых (вид белка) нитей. Каждая молекула, оказавшись внутри клетки, в зависимости от своей структуры попадает на определенную дорогу и движется строго по ней в определенное место. Поняв принцип работы внутриклеточных путей сообщения, можно использовать их для точной адресной доставки лекарств. Для этого достаточно выяснить, какой путь ведет в нужное место, а также типы молекул, движущихся по нему. Пришив наноконтейнер с лекарством к подобной молекуле, можно отправить ее по требуемому адресу. Причем такая доставка происходит за счет универсальной энергии АТФ, представляющей собой наиболее эффективное «топливо» с коэффициентом полезного действия равным 92%. В данной реакции энергия химической связи сразу превращается в механическую, минуя тепловую стадию. Такой природный мотор с высокой эффективностью работает во всех живых организмах без исключения.

Учеными МГУ, РАН и Кардиоцентра была разработана технология, когда белок миозина, обладающий естественной способностью двигаться по актиновым нитям, пришивается к наноконтейнеру с лекарством. В результате порция лекарства «ползет» по внутриклеточным рельсам в нужное место без каких либо затрат энергии.

Любые таблетки, капсулы, которые мы глотаем, помимо терапевтического действия оказывают также побочное влияние на весь организм. А использование наноконтейнеров, доставляющих препарат «куда надо», сведет это побочное воздействие практически к нулю.

МЕТОДЫ ОЦЕНКИ БИОБЕЗОПАСНОСТИ НАНОЧАСТИЦ IN VITRO

Методы, используемые для оценки взаимодействия наночастиц с белками
Прямое и динамическое лазерное светорассеяние
Гельхроматография
Флуоресцентная спектроскопия


Биосенсоры

В диагностике важно иметь возможность выделить интересующие нас в данный момент внутриклеточные процессы и следить за ними в реальном времени. Член-корреспондент РАН С.А. Лукьянов из Института биоорганической химии предложил оригинальное решение задачи.

Ученый разработал технологию, меняющую структуру гена так, что флуоресцирующая часть белка сохраняется, а другая приобретает способность определенным образом связываться с любым заранее выбранным внутриклеточным веществом (врезка слева). На первый взгляд, подобная технология открывает широкие возможности для определения пути любого соединения внутри живой клетки.

Следует отметить, что можно создать флуоресцирующий белок, связывающийся с кальцием. Причем при связывании иона флуоресценция белка будет возрастать. Далее ген с измененной структурой вводится, например, в зародышевую клетку мыши. Когда животное вырастет, изменение концентрации кальция в его клетках будет сопровождаться изменением интенсивности зеленого света в различных местах. Клеточный метаболизм химического элемента становится видимым во всех деталях. Можно следить, как при различных болезнях изменяется концентрация ионов кальция в клетках, как лечение влияет на их восстановление и т.д. Аналогичным способом можно отслеживать метаболизм других веществ. Такой метод открывает широкие возможности для визуализации жизненно важных процессов и позволяет непосредственно проверять эффективность того или иного лечения.

В каждой клетке существует программа самоуничтожения, так называемый апоптоз, включаемая через определенный промежуток времени (см.: Королева А., Скулачев В., Скулачев М. Выбор между жизнью и смертью // ВМН, № 2, 2008). Такой чрезвычайно важный для понимания жизнедеятельности организма процесс еще до конца не ясен. Однако известно, что он сопровождается увеличением внутриклеточного содержания перекиси водорода. С.А. Лукьянов синтезировал ген, производящий флуоресцентный белок, который связывается с гидроперитом. Это дало возможность наблюдать весь процесс клеточного апоптоза в реальном времени. Можно также отслеживать путь вводимого в организм лекарства или любого другого вещества.

Не навреди!

Известно, что все полезное полезно лишь в определенных количествах, прием сверх меры, как правило, наносит вред. Еще Парацельс говорил, что все есть яд, и только правильная доза делает вещество безопасным. Соответственно, и наночастицы, несмотря на свои сверхмалые размеры, могут быть также опасны. В связи с этим разрабатываются процедуры их тестирования, аналогичные тем, что используются для обычных лекарств. Например, не исключено, что наночастицы способны вызывать агрегацию белков, а это впоследствии может привести к болезни Альцгеймера и т.п. Поэтому все нанопрепараты проходят доклиническое испытание (врезка вверху). Последовательно проверяется их влияние на морфологию, развитие и движение клеток, на обмен веществ и т.д. И только после этого для каждого конкретного случая подбираются оптимальные природа, размер и доза наночастиц.

Великое объединение

Сегодня биологические науки развиваются стремительно. Открытия в этих областях человеческой деятельности происходят чуть ли не каждый день. Специалисты изучают, как функционируют вирусы, бактерии, различные внутриклеточные структуры, и затем перенимают у них «опыт работы» для решения фундаментальных и прикладных задач. Физики и инженеры все глубже погружаются в микромир, осваивают новые нанотехнологии и уже умеют манипулировать отдельными молекулами. Можно ожидать, что в ближайшем будущем при исследовании внутриклеточных процессов произойдет объединение квантовой механики, молекулярной биологии, генной инженерии, биохимии, медицины и неорганической химии. В результате такого «великого объединения» наверняка произойдет качественный скачок в понимании того, что же такое жизнь, а медицина обогатится новыми методами для диагностики и лечения человека.

Беседовал Василий Янчилин

http://www.sciam.ru/article/4044
--------------------------------------------------------------------------------

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА

Третьяков Ю.Д. Нанотехнологии. Азбука для всех. М.: Физматлит, 2008.
Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. Биология. М.: Мир, 2006.
Рис Э., Стернберг М. Введение в молекулярную биологию. От клеток к атомам. М.: Мир, 2002.
Физиология человека. Под ред. Г. Тевса и Р. Шмидта. М.: Мир, 2007.