< Противоопухолевые вакцины

--------------------------------------------------------------------------------

С.А.Коростелев

ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

--------------------------------------------------------------------------------

Многие годы классическими методами лечения опухолевых заболеваний являются хирургия, химио- и радиотерапия. Однако в последние десятилетия качественных успехов в лечении опухолевой патологии с помощью этих методов добиться не удалось. Сегодня прогресс в лечении онкологических заболеваний связан с существенным прорывом в молекулярной биологии, иммунологии, понимании причин возникновения опухолевой клетки и закономерностей развития опухолевого процесса. Как известно, в организме существует целый ряд механизмов, позволяющих противостоять появлению и развитию опухоли. Это антиоксидантная и репаративная системы, блокирующие появление опухолевых клеток, а также иммунная система, работа которой направлена в том числе и на элиминацию клеток, несущих признаки отличия от нормальных тканей человека.
Попытки стимуляции иммунной системы для лечения рака предпринимались давно и неоднократно. Однако лишь в последние годы удалось добиться определенного эффекта от применения ряда иммуномодулирующих препаратов. Прежде всего это бактерии и их компоненты (БЦЖ), некоторые синтетические препараты (левамизол), интерфероны и интерлейкины. Наиболее эффективным является их применение при раке мочевого пузыря, раке почки и меланоме. В других случаях клинический эффект неспецифической иммуностимуляции не очень убедителен. Современная эра онкоиммунологии началась с открытия опухолевых антигенов и разработки методов формирования специфического иммунного ответа против них. Этот подход лежит в основе создания противоопухолевых вакцин, с которыми связаны перспективы существенного повышения эффективности противоопухолевой иммунотерапии. Механизм действия противоопухолевых вакцин в общем сходен с таковым у вакцин, применяемых для профилактики инфекций, и в основе его лежит формирование специфического иммунного ответа на антиген. Основное отличие противоопухолевых вакцин состоит в том, что их использование для профилактики невозможно из-за многочисленности различных видов опухолей и непредсказуемости их появления. Их применение целесообразно только для максимальной индукции иммунного ответа на уже существующую опухоль.

Причины иммунологической толерантности опухолей
Основной причиной низкого иммунного ответа или его отсутствия в отношении опухоли являются слабые различия между нормальной и опухолевой клеткой. Так, даже нормально функционирующая иммунная система зачастую не может распознать опухолевую клетку и как следствие уничтожить ее. С другой стороны, активный рост опухоли может приводить к селекции клона опухолевых клеток в сторону клеток, несущих меньше опухолевых антигенных детерминант или имеющих другие антигенные детерминанты за счет уничтожения только клеток с выраженным иммуногенным потенциалом. Доказаны факты потери опухолевыми клетками молекул главного комплекса гистосовместимости, которые играют важную роль в распознавании антигена и реализации Т-клеточного иммунитета. Ограниченная локализация опухолевых антигенов в месте развития опухоли и низкая их концентрация в лимфоидных органах приводит к запаздыванию иммунного ответа, и он развивается в поздних стадиях, когда начинается процесс диссеминации опухолевых клеток или их гибель и концентрация опухолевых антигенов в органах и тканях иммунной системы повышается. Можно однозначно говорить об отрицательной роли секреции опухолевыми клетками иммуносупрессивных факторов и апоптических сигналов в формировании локальной или системной иммунодепрессии. Определенной причиной иммунологической толерантности является и нарушение механизма представления опухолевого антигена эффекторным клеткам иммунной системы (в отсутствии костимулирующих факторов, продуцируемых другими клетками иммунной системы). В каждом конкретном случае, вероятно, доминирует какой-либо из этих факторов, но при разработке подходов к специфической иммунотерапии опухолей необходимо учитывать значение каждого их них.

Стратегия создания противоопухолевых вакцин
Если рассмотреть механизм формирования иммунного ответа, в нем можно выделить несколько таких этапов, модификация которых может приводить к существенному усилению образования цитолитических (СD8+) Т-лимфоцитов, которые играют ключевую роль в элиминации опухолевых клеток. Первым моментом, с которого начинается развитие иммунной реакции как клеточного, так и гуморального типа, является способность антигенпрезентирующей клетки захватывать, обрабатывать и представлять другим клеткам иммунной системы опухолевые антигены. Примером таких антигенпрезентирующих клеток являются эпидермальные клетки Лангерганса, а также макрофаги, некоторые субпопуляции В-лимфоцитов и другие дендритные клетки. Захваченные путем фагоцитоза, антигены процессируются до пептидных фрагментов и представляются на поверхности антигенпрезентирующей клетки в комплексе с HLA-молекулами (клеточными детерминантами главного комплекса гистосовместимости) I и II класса, что в дальнейшем приводит к активации специфических хелперных (CD4+) и цитолитических (CD8+) Т-лимфоцитов. Хелперные (СD4+) Т-лимфоциты секретируют ряд цитокинов, стимулирующих активированные цитолитические (CD8+) Т-лимфоциты, которые в свою очередь распознают и уничтожают опухолевые клетки. Для активации цитолитических (CD8+) Т-лимфоцитов необходим также ряд костимулирующих молекул (В7.1, В7.2, ICAM1 и т.д.), отсутствие которых приводит к анергии или даже гибели Т-клеток.
Оказывая влияние на тот или иной этап формирования иммунного ответа, можно добиться существенного увеличения количества и активности цитолитических (СD8+) Т-лимфоцитов, специфичных по отношению к определенному антигену, и, соответственно, повысить их противоопухолевый эффект. Поэтому основную стратегию создания противоопухолевых вакцин можно рассматривать как определение мишеней иммунного ответа (специфичных опухолевых антигенов), создание иммуногенных форм и условий для распознавания таких антигенов, а также индукцию пролиферации и повышение активности сенсибилизированных иммунокомпетентных клеток.

Опухолевые антигены
Белки, экспрессируемые опухолевой клеткой и являющиеся потенциальными антигенами, способными индуцировать иммунный ответ, можно разделить на несколько групп. Прежде всего это нормальные белки, кодируемые геномом клетки – опухолеассоциированные антигены. К ним можно отнести тканеспецифичные белки, присутствующие как на нормальных клетках, так и на опухолевых клетках, имеющих происхождение из этой ткани (дифференцировочные антигены). Примером таких антигенов являются меланомные антигены (тирозиназа, gp100, MART-1/Melan-A, TRP), которые являются белками, вовлеченными в синтез меланина. Широко распространен ряд антигенов, экспрессированых в нормальных тканях в минимальных уровнях, недостаточных для индукции иммунного ответа и гиперэкспрессированных на опухолевых клетках, что позволяет использовать их в качестве мишеней для специфической иммунотерапии рака – простатспецифические антигены (PSA/PSMA), уровень которых повышается при аденокарциноме простаты [1, 2]; муцин (MUC1) – повышение которого ассоциируется с раком молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы [3]; HER-2/neu – обнаруживается при раке легких, яичников, молочной железы, простаты и толстой кишки [4]. Онкофетальные антигены, присутствующие на ранних стадиях развития эмбриона и исчезающие после, могут вновь появляться при некоторых опухолях: раковоэмбриональный антиген (CEA), обнаруживаемый в пищеварительном тракте, поджелудочной железе и печени на 2–6-й неделе гистогенеза, присутствует при раке толстой кишки, легких, молочной железы [4]; альфа-фетопротеин (AFP), продуцируемый эмбриональными печеночными клетками и желточным мешком, присутствует в сыворотке крови взрослых в малых количествах и повышается у некоторых пациентов при раке печени [5]. Уровень теломеразы, присутствующей в стволовых клетках и исчезающей при их дифференцировке, повышается в опухолевых клетках, и, хотя она не является сильным антигеном, при определенных условиях также возможно индуцировать против нее иммунный ответ [6]. Неоантигены, не экспрессирующиеся на клетках тканей, из которых образуется опухоль, экспрессируются на других нормальных тканях. Появление таких антигенов является реактивацией генов, "молчащих" в нормальных клетках при их опухолевой трансформации. Так, раково-тестикулярные антигены (MAGE, BAGE, GAGE, LAGE, SAGE, NY-ESO и т.д.) не экспрессируются на меланоцитах, но присутствуют на клетках меланомы и нормальных клетках яичек и плаценты [7]. Аналогично ганглиозидные антигены появляются на меланоцитах только после их неопластической трансформации и всегда присутствуют на клетках спинного и головного мозга [8]. Опухолеспецифичные антигены экспрессируются только на опухолевых клетках. К ним относятся мутантные антигены, экспрессируемые клетками с повреждениями ДНК. Такие модифицированные молекулы (бета-катенин, CDK4, P53 и др.) экспрессируются далеко не во всех опухолях, так как вероятность одинаковых мутаций невысока [9, 10]. Fusion антигены являются продуктами генов, находящихся в обычных условиях в разных местах хромосомы, а при мутации образующих единую последовательность (bcl-abr, abr-bcl, pml-RAR и т.д.), что достаточно часто встречается при различных формах лейкозов [11]. Отдельно следует выделить вирусные антигены – белки, экспрессируемые на поверхности инфицированных клеток и ассоциирующиеся со злокачественной трансформацией клетки вирусной этиологии. К ним прежде всего относятся белки (Е6, Е7) вируса папилломы человека, ассоциированного с раком шейки матки, вирусы Эпштейна–Барр, а также вирусы герпеса, гепатита В и т.д. [12, 13].
К настоящему времени более 100 белков являются кандидатами для создания на их основе противоопухолевых вакцин, и их количество непрерывно растет. На сегодняшний день используются разные методы идентификации опухолевых антигенов, но наиболее успешным является технология получения кДНК из опухолевых клеток, ее клонирование с последующим получением белков, кодируемых этими генами, которые затем тестируются в качестве антигена для индукции иммунного ответа на исходные опухолевые клетки.

Вакцины на основе отдельных антигенов
Вакцины на основе отдельных антигенов могут включать опухолевые антигены, полученные из стандартизованных линий опухолевых клеток или с помощью рекомбинантных технологий. Важно, чтобы такие белки были достаточно очищенными, в том числе и от HLA-антигенов, чтобы не индуцировать анти-HLA-иммунный ответ. Исследования с очищенными ганглиозидами показали, что на них развивался достаточно выраженный иммунный ответ. Так, от 50 до 80% больных меланомой (III стадия) демонстрировали повышение титра IgM- и IgG-антител при использовании вакцины, содержащей GM2- и GD2-ганглиозиды, что можно считать прогностически положительным признаком при этом заболевании [14, 15]. Пептидные антигены потенциально являются более эффективным средством иммунизации по сравнению с цельными белками, поэтому они чаще включаются в состав противоопухолевых вакцин. Идентификация антигенных детерминант опухолевых антигенов, как правило пептидов из 8–9 аминокислотных последовательностей, позволила получать их методами химического синтеза и использовать для создания противоопухолевых вакцин. Наиболее широко проводятся экспериментальные и клинические испытания раково-тестикулярных и меланомных синтетических пептидных антигенов, в основном при меланоме, с определенным положительным эффектом [16, 17]. Однако гетерогенность антигенов на различных клетках одной опухоли (или ее метастазах) может приводить к селекции опухолевого клона и, соответственно, формировать резистентные к такой вакцинотерапии клоны. По этой причине предпочтительнее использовать вакцины, в состав которых входит несколько высокоочищенных или синтетических антигенов (поливалентные вакцины), что повышает вероятность индукции иммунного ответа в отношении различных клеточных клонов одной опухоли [18].
В то же время существенным препятствием для массового использования таких вакцин является индивидуальный для каждой опухоли набор опухолевых антигенов, что определяет необходимость в каждом случае тестировать опухоль на наличие тех или иных мишеней и определять соответствующий антиген для включения его в состав вакцины. Такое тестирование вполне доступно методами, основанными на полимеразной цепной реакции или иммунохимии, что позволяет подобрать набор антигенов для вакцинотерапии. К сожалению, недостаточность данных о специфических антигенных детерминантах при многих опухолях ограничивает использование отдельных антигенов для противоопухолевой иммунотерапии.
Другой недостаток пептидных вакцин – проблема, называемая HLA-рестрикция. Известно, что необходимым условием взаимодействия иммунокомпетентных клеток в иммунном ответе является экспрессия на их мембранах HLA-антигенов, причем взаимодействующие клетки должны иметь один и тот же тип HLA. Этот комплекс, связываясь с антигенными детерминантами, участвует в их презентации между иммунокомпетентными клетками. HLA-рецепторы могут связываться с пептидами только в пределах некоторого размера, формы и электрического заряда их антигенсвязывающего участка, означая, что каждый HLA-рецептор имеет ограниченный набор пептидов, которые он может представить на поверхности клетки. Таким образом, если пептид не может связаться с антигенсвязывающим участком HLA-рецептора, вакцина, основанная на этом пептиде, будет неэффективна. Поэтому оптимальное использование пептидных вакцин требует HLA-типирования ткани пациента для того, чтобы выбрать пептидные антигены, совместимые с HLA-рецепторами больного.
Преимущество вакцин, основанных на пептидных антигенах, состоит в том, что они доступны для массового производства, имеют относительно небольшую коммерческую стоимость и к ним применимы стандартные требования, принятые для лекарственных препаратов.

Идиотипические вакцины
Идиотипические вакцины широко изучаются при В-клеточных лимфопролиферативных заболеваниях. В этом случае в качестве антигена могут выступать CDR (complementarity determining regions) участки вариабельного (V) района антител, продуцируемых лимфоидной клеткой (идиотипы). Каждая опухоль экспрессирует уникальный идиотип, который является высокоиммуногенным в аллогенной системе и слабым в аутологичной [19]. Тем не менее на животных моделях показано, что вакцинация опухолеспецифичными идиотипами предотвращает развитие перевиваемых опухолей [20]. Клинические испытания показали, что при введении идиотипической вакцины у большей части пациентов с В-клеточной лимфомой (до 80%) развивается иммунный ответ на используемый идиотип. Это коррелирует с существенным увеличением периода ремиссии и выживаемостью пациентов, особенно у пациентов с высоким антиидиотипическим иммунным ответом клеточного типа [21, 22]. Положительные результаты, наблюдаемые при низкодифференцированных лимфомах, подтвердились и при идиотипической вакцинации больных с множественной миеломой, когда развитие иммунного ответа сопровождалось ремиссией заболевания [23].

Антиидиотипические вакцины
В качестве индуктора специфического иммунного ответа могут выступать и антиидиотипические антитела (антитела против антител к опухолевым антигенам), которые способны имитировать опухолевые антигены. Такие вакцины, с одной стороны, формируют специфический иммунный ответ на опухолевый антиген, а с другой стороны, являясь иммунокомпетентными молекулами, могут существенно повышать уровень этого иммунного ответа. Положительным свойством таких вакцин является высокая способность преодолевать толерантность по отношению к опухолевым антигенам. В экспериментальных моделях показано, что использование антиидиотипических антител индуцирует выраженный противоопухолевый иммунный ответ к различным опухолевым антигенам [24]. Клинические испытания вакцин на основе антиидиотипических антител, имитирующих СА125-антиген, показали, что при раке яичников развивается специфический иммунный ответ на СА125-антиген, коррелирующий со стабилизацией опухолевого процесса [25]. Подобные результаты получены и при использовании антиидиотипических антител, имитирующих ганглиозидный антиген GD2 у пациентов с III стадией меланомы [26]. Проводятся исследования антиидиотипических антител к опухолевым антигенам при раке молочной железы и колоректальной карциноме [27, 28].

ДНК-вакцины
Такие вакцины представляют собой генетическую последовательность, которая кодирует опухолевый антиген. Она встроена в систему доставки (плазмида, вирусный вектор и т.д.) и содержит промотор, обеспечивающий экспрессию экзогенного белка в эукариотических клетках. Эти конструкции, введенные в мышечную ткань или подкожно, трансфецируют клетки пациента (фибробласты или миоциты). Результатом активации введенного гена является повышение локальной концентрации необходимого антигена и как следствие развитие иммунного ответа на него [29]. Такая генетическая конструкция может содержать несколько антигенных детерминант, что повышает вероятность их совпадения с антигенами опухоли и, соответственно, развития противоопухолевого иммунного ответа. В то же время применение таких вакцин также ограничивается опухолями с определенными антигенными детерминантами (как и всех антигенспецифических вакцин). Достаточно много исследований было проведено с генетическими конструкциями, содержащими репликативно некомпетентные рекомбинантные вирусы (vaccinia, avipox, CMV) и опухолеассоциированные антигены (MART-1, GP100, CEA, PSA). Однако иммунный ответ на такие антигены был весьма умеренным, возможно, из-за присутствия нейтрализующих антител против белков вируса или недостаточным уровнем трансфекции [30–32]. В то же время достаточно выраженный иммунный ответ наблюдается при использовании в ДНК-вакцинах ксеноантигенов, что позволяет рассматривать их перспективными при лечении рака вирусной этиологии, например вызываемого вирусом папилломы человека рака шейки матки [34, 35].
Повысить иммуногенность ДНК вакцин удается при увеличении вводимой дозы, так как для индукции достаточного иммунного ответа для человека необходимы более высокие уровни доз по сравнению с лабораторными животными. Включение в такие вакцины нескольких антигенных детерминант и биологических модификаторов иммунного ответа, таких как IL-2, GM-SCF и др., также приводит к усилению их эффективности. Очевидно, что вариантами ДНК-вакцин могут быть следующие: генетическая конструкция, кодирующая антиген (антигены); генетическая конструкция, кодирующая как антиген (антигены), так и биологический модификатор в одной плазмиде; две плазмиды, содержащие такие гены и вводимые совместно или раздельно.
Главное преимущество этого типа вакцины состоит в том, что их производство не требует клеточного материала или индивидуализированных манипуляций с ДНК, она достаточно стабильна, что делает доступным производство таких препаратов в больших количествах. ДНК легко изменяема в лабораторных условиях, поэтому возможно легкое создание вакцин против различных антигенов. Антигенные белки продуцируются в клетках в нативной конформации, что иногда способствует повышению их иммуногенности.
Основной проблемой, связанной с созданием таких вакцин, является выбор систем доставки. В настоящее время широко используются липосомы (для плазмидной ДНК) и аденовирусные векторы. Недостатком первого является низкая степень трансфекции, а во втором случае возможны побочные реакции на антигены вирусного вектора. Кроме того, при создании таких вакцин необходимо учитывать возможность интеграции вводимого генетического материала в геном человека, индукцию аутоиммунных (анти-ДНК) антител и возможную иммунологическую толерантность на используемый антиген, а также вариабельность сроков, в течение которых клетки организма будут вырабатывать антигенный белок.

Вакцины на основе опухолевых клеток
Вакцины на основе опухолевых клеток представляют собой живые аллогенные или аутологичные опухолевые клетки, пролиферативные способности которых ограничены различными методами: облучением, митомицином С либо лизированные замораживанием и размораживанием или тепловым воздействием клетки. Однако такое воздействие может изменять структуру и свойства опухолевых антигенов и, соответственно, уменьшать эффективность вакцины. Тем не менее присутствующий в этом случае широкий спектр антигенов определяет возможность их использования при соответствующей опухоли без оценки экспрессии отдельных антигенных детерминант.
Основное преимущество аутологичных вакцин заключается в том, что они идентичны клеткам опухоли с соответствующими белками HLA и другими структурами, активирующими клеточный иммунный ответ, поэтому исчезают проблемы несовпадения антигенного профиля вакцины и опухоли и аллергических реакций на чужеродные неопухолеспецифичные антигены, что снижает риск связанных с этим осложнений, так же как и снижает риск контаминации патогенными вирусами и внутриклеточными паразитами. Кроме того, такие клетки достаточно долго могут находиться в организме, что важно для развития иммунного ответа. К сожалению, антигенный профиль опухолевых клеток, полученных из разных мест (основная опухоль, метастазы, лимфоузлы) может существенно различаться. К тому же не всегда есть возможность получить достаточное количество опухолевого материала от больного, а в случае наличия такой возможности сложностью является получение однородной стандартизованной популяции опухолевых клеток, пригодных для получения вакцины. Такие вакцины являются фактически индивидуальными, и стоимость их возрастает существенно. Тем не менее такие вакцины проходят уже II и III фазу клинических испытаний, в частности при меланоме, с определенным положительным эффектом [36].
В случае использования аллогенных клеток вероятность совпадения антигенов вакцины и опухоли снижается, поэтому такие вакцины создаются, как правило, из клеточных линий, взятых у нескольких больных (поливалентные вакцины). Смесь клеточных линий от нескольких сходных опухолей может содержать достаточно широкий спектр опухолевых антигенов. Такой вариант вакцин позволяет существенно повысить вероятность совпадения антигенов вакцины и больного. Преимущество этих вакцин состоит в том, что они не требуют взятия опухолевых клеток у пациента и возможно получение достаточного их количества для нескольких иммунизаций. Примером такой вакцины является поливалентная меланомная клеточная вакцина (PCMV), разработанная Morton и соавт. [37], которая состоит из трех аллогенных меланомных клеточных линий с высокой экспрессией поверхностных иммуногенных глико- и липопротеинов и ганглиозидов. Клинические испытания такой вакцины показали, что развитие иммунного ответа как клеточного, так и гуморального типа на эти антигены коррелировало с повышением выживаемости пациентов [37, 38]. Определенным препятствием при использовании аллогенных клеток является различие HLA-антигенов пациента и клеток вакцины, что может вызывать не только реакции по типу трансплантационного иммунитета, но и существенно влиять на эффективность вакцинотерапии. Так, например, Melacine (Сorixa corp., Canada), вакцина, состоящая из лизата аллогенных меланомных клеточных линий, вызывает противоопухолевый эффект у 5–10% больных меланомой. Однако этот показатель существенно повышается у больных с такими HLA-антигенами I класса, как А2 или С3 [39]. Вероятно, при использовании таких вакцин необходим подбор пациентов с учетом их НLA-антигенов. Сложно говорить об эффективности таких вакцин в случае незначительного совпадения антигенов вакцины и опухоли. К тому же длительное пассирование таких клеток может приводить к модификации антигенного фенотипа клеток. К сожалению, их нестабильность требует особых условий производства, хранения и транспортировки. Кроме того, существенные сложности возникают при стандартизации таких препаратов. В некоторой степени лишены этих недостатков вакцины на основе лизированных клеток из аллогенных лабораторных клеточных линий, так как на их основе возможно изготовление более стандартизованного и стабильного препарата [40, 41]. Однако проблемы контроля качества и эффективности таких вакцин, а также проблемы их стандартизации могут существенно ограничить их будущее применение. Вероятно, именно с этим связан тот факт, что в большинстве проведенных в последние десятилетие рандомизированных исследований таких вакцин не было получено очевидной противоопухолевой активности [33, 40–42].

Адъюванты
Другая задача при создании противоопухолевых вакцин состоит в повышении иммуногенности входящего в их состав антигена либо усилении специфического иммунного ответа на него. Поэтому вторым компонентом таких вакцин практически всегда являются адъюванты, спектр которых очень широк: от простых молекул, называемых гаптенами, до модифицированных живых клеток. Ранее основным требованием, предъявляемым к адъювантам, была стимуляция гуморального звена иммунной системы, и они включались в состав противоинфекционных вакцин или использовались у животных для индукции выработки иммуноглобулинов. Оказалось, что многие из них вполне способны стимулировать клеточный иммунитет и пригодны для включения в противоопухолевые вакцины.

Гидроокись алюминия
Этот адъювант используется в составе противоинфекционных вакцин уже более 70 лет. Первоначально предполагалось, что гидроокись алюминия образует гелевый матрикс, который увеличивает время нахождения антигена в месте введения, тем самым повышая его иммуногенность (эффект депо). Кроме того, адъювантные свойства связываются с абсорбцией протеина на основе разницы электрического заряда. Поэтому в отношении разных белков его свойства очень различаются в зависимости от их электрического потенциала. Позже in vitro показано, что этот адъювант повышает на моноцитах периферической крови экспрессию HLA-антигенов II класса, молекул В7-2 (СD86) и CD83, которые являются маркерами зрелости дендритных клеток. Также повышается экспрессия костимуляторных молекул и молекул адгезии ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58), CD40 и продукция IL-4, что сопровождается изменением морфологии моноцитов в сторону дендритных клеток [121]. В онкологии гидроокись алюминия применяется для создания противоопухолевых вакцин на основе антиидиотипических антител, имитирующих антигены меланомы, рака молочной железы, колоректальной карциномы [28, 47]. В общем адъюванты на основе солей алюминия более слабые по сравнению с другими адъювантами, однако и побочные воспалительные реакции у них выражены слабо [47].

Гаптены
Это обычно вещества с низкой молекулярной массой или небольшая функциональная группа, представляющая собой одну детерминанту. Гаптенами могут быть органические соединения, моно- и олигосахариды, а также олигопептиды. Гаптены самостоятельно не способны вызвать развитие иммунной реакции. Они приобретают иммуногенность при соединении с подходящим белком-носителем или поверхностным рецептором на клетке. В этом случае иммунный ответ вырабатывается как на гаптен, так и на связавшийся с ним антиген. Гаптен, наиболее часто используемый для создания противоопухолевых вакцин, – это динитрофенил. Положительные клинические результаты получены при использовании конъюгатов динитрофенила с аутологичными опухолевыми клетками при раке яичника и меланоме. Так, например, у 13% пациентов с IV клинической стадией меланомы наблюдалась полная или частичная регрессия метастазов. 5-летняя выживаемость при применении этой вакцины у пациентов с III стадией этого заболевания повышалась до 50%, что существенно выше, чем при оперативном лечении (22–32%) или использовании высоких доз альфа-интерферона (32%). Причем у пациентов, имевших положительную реакцию гиперчувствительности замедленного типа на аутологичные меланомные клетки, не конъюгированные с динитрофенилом, этот показатель был еще выше [36].

Гемоцианин
Ряд исследований посвящен применению в противоопухолевых вакцинах адъювантов на основе гемоцианина – дыхательного пигмента гемолимфы некоторых морских беспозвоночных животных, обеспечивающий транспорт кислорода в их организме. По химической природе это медьсодержащий белок, придающий крови этих животных синий цвет. Являясь иммуноактивной молекулой, гемоцианин при образовании коньюгатов с опухолевыми антигенами существенно повышает их иммуногенность. Показано, что этот адъювант способствует преодолению иммунологической толерантности или усиливает иммунный ответ на ганглиозидные антигены (GM2, GD2, GD3). Обнаружен высокий уровень Т-клеточного иммунного ответа при использовании конъюгатов этого белка с муцином (MUC1). В качестве индукторов противоопухолевого ответа могут использоваться только указанные конъюгаты или их комбинации с другими адъювантами [43]. Они также могут применяться в технологии получения дендритных вакцин [44]. Проводятся клинические исследования противоопухолевых вакцин с использованием этого адъюванта совместно с идиотипическими антителами при В-клеточной лимфоме и антиидиотипическими антителами при колоректальной карциноме [21, 28].

Адъювант Фрейнда
Адъювант Фрейнда создан на основе минерального масла, сурфактанта и микобактерий (если он полный). Используется достаточно давно, и его эффект основан на создании “депо”, в котором антиген сохраняется длительное время в высокой концентрации, что повышает его иммуногенность. В клинических испытаниях вакцин, содержащих пептидные антигены и неполный адъювант Фрейнда, показано повышение антигенспецифических Т-лимфоцитов к меланомным антигенам GP100, G209-2M у большинства иммунизированных больных меланомой [48]. По этому принципу создано несколько адъювантов с различным соотношением водной и масляной фазы с разными сурфактантами и комбинациями масел. Основная цель таких модификаций – добиться максимальной специфичности иммунного ответа на совместно введенный антиген с минимальными побочными эффектами (прежде всего воспалительными). Так, на основе минерального масла создан коммерческий адъювант Montanide (Seppic, France), который относится к группе адъювантов на основе масла и сурфактанта и используется в виде водно-масляных эмульсий. Его включают в состав вакцин, содержащих пептидные эпитопы меланомы и вируса папилломы человека [49–51].

Сурфактанты
Поверхностно-активные вещества, которые являются компонентами всех эмульсионных адъювантов, могут выполнять адъювантные функции самостоятельно, так же как и помогать стабилизировать водно-масляные эмульсии. На основе сапонинов мыльного дерева создан адъювант QS-21 (Antigenics, USA), показывающий особенно хороший стимулирующий эффект в отношении цитолитических Т-лимфоцитов [52]. Это свойство позволяет включать его в состав противоопухолевых вакцин при меланоме [26, 49].

Бактериальные адъюванты
Классическим примером бактериальных адъювантов является БЦЖ, свойство которой активировать иммунную систему делает возможным использование ее в различных формах иммунотерапии, например как стандартный препарат, используемый при лечении рака мочевого пузыря или включаемый в противоопухолевую вакцину. Достаточно много клинических испытаний противоопухолевых вакцин проводится сейчас с использованием этой бактерии. Как правило, БЦЖ используют в составе аутологичных или аллогенных клеточных вакцин. Так, при раке почки (IV стадия) применение вакцины, состоящей из аутологичных опухолевых клеток и БЦЖ, вызывает стабильный клинический эффект у 27% больных [53]. Повышение выживаемости иммунизированных больных (до 37 мес против 17 мес в контроле) наблюдается у больных меланомой при использовании аллогенной поливалентной клеточной вакцины и БЦЖ [54]. Подобные результаты получены и при использовании аутологичных меланомных клеток [55]. В других же случаях, например при раке толстой кишки, применение аналогичной вакцинации клинического эффекта не имело [56]. К сожалению, эффекты от применения БЦЖ (в том числе и побочные) не всегда предсказуемы. Поэтому основной путь развития бактериальных адъювантов состоит в том, чтобы активизировать их иммуностимулирующий потенциал и минимизировать воспалительные побочные эффекты. Безусловным преимуществом в этом отношении являются индивидуальные химические соединения. Например, некоторые адъюванты нового поколения включают химические варианты эндотоксинов, называемые монофосфориллипидами, модифицированный мурамоилдипептид или другие детоксицированные компоненты бактериальной стенки. К коммерческим продуктам отностится DETOX – жирорастворимый адъювант, получаемый из стенки бактерий, содержащий нетоксичный липид А (монофосфорил липид А из S. Minnesota) и структуры клеточной стенки Mycobacterium phlei в скваленовом масле и Твине 80. Этот адъювант используется в составе меланомной вакцины Melacine [39].

Вирусные адъюванты
В некоторых экспериментальных исследованиях показано, что использование в качестве антигена вирусного лизата опухолевых клеток существенно увеличивает их иммуногенность [57]. При клинических испытаниях показано, что вирусный (Newcastle) онколизат аутологичных и аллогенных опухолевых клеток повышает выживаемость больных меланомой [58]. Получены положительные результаты клинических исследований с использованием меланомного онколизата и вируса коровьей оспы (vaccinia), в которых повышение уровня иммунного ответа коррелировало с выживаемостью больных [59, 60]. Однако в рандомизированном исследовании с вирусом коровьей оспы эффективность вакцинации отмечена только в некоторых группах больных меланомой [61].

HLA-молекулы
Экспериментальные исследования показывают, что введение аутологичных опухолевых клеток трансфецированных аллогенными HLA-антигенами I класса приводит к развитию специфического противоопухолевого иммунного ответа и предотвращает развитие перевиваемых опухолей [45]. В этом случае развитие противоопухолевого иммунного ответа тесно связано с развитием иммунного ответа на используемый аллоантиген. Вероятно, это происходит через антигенпрезентирующие клетки, которые, активируясь аллогенным антигеном, захватывают вместе с ним и опухолевый антиген, также презентируя его Т-лимфоцитам (кросс-презентация). Кроме того, НLA-антигены вызывают выраженный иммунный ответ, сопровождающийся повышением локальной концентрации стимулирующих цитокинов, которые также стимулируют и опухолеспецифичные цитолитические Т-лимфоциты. При этом такие сформировавшиеся цитолитические Т-лимфоциты вполне способны уничтожать и опухолевые клетки, не несущие на себе чужеродных HLA-антигенов. Клинические испытания вакцины на основе HLA-B7/b2-микроглобулинтрансфецированных аутологичных меланомных клеток показали ее способность вызывать частичную ремиссию (4%) или стабилизацию процесса (18%) у пациентов с множественной рецидивирующей или резистентной к стандартному лечению меланомой [46].

Костимулирующие молекулы
Известно, что костимулируюшие молекулы В7-1 (CD80), молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58) усиливают антигенспецифическую Т-клеточную активацию. С использованием рекомбинантной технологии созданы векторы, с помощью которых генами, кодирующими указанные молекулы, можно трансфецировать опухолевые клетки, используемые затем для вакцинации. Такой подход показал эффективность при экспериментальных исследованиях при В-клеточной лимфоме [87]. В других вариантах указанный вектор помимо костимулирующих молекул включал и простатспецифический, раковоэмбриональный и другие антигены [89, 90].

CpG-олигонуклеотиды
Бактериальная ДНК содержит неметилированные CpG-динуклеотиды, которые гораздо реже встречаются в ДНК человека. Они действуют как сигналы опасности для клеток иммунной системы позвоночных и активируют врожденный и приобретенный иммунный ответ. Некоторые клетки иммунной системы имеют рецепторы (TLR9), способные связываться с CpG-последовательностями и таким образом запускать целый каскад сигналов, которые в конечном итоге приводят к активации врожденного и приобретенного иммунного ответа. Такие иммуностимулирующие свойства CpG-олигодеоксинуклеотидов определяют возможность их использования для иммунотерапии опухолей. В экспериментальных исследованиях на животных показана эффективность использования CpG-олигодеоксинуклеотидов с различными опухолевыми антигенами для специфической противоопухолевой вакцинации. CpG, содержащие олигодезоксинуклеотиды, обладают существенно большей активностью по сравнению с адъювантом Фрейнда и применяются как самостоятельно, так и в комбинации с другими адъювантами. Иммуностимулирующя активность синтетических олигодеоксинуклеотидов, содержащих CpG-последовательности, может быть аналогичной таковым из бактериальной ДНК, что существенно облегчает задачу получения чистого и стандартизованного препарата. И хотя механизмы реализации иммуностимулирующих свойств CpG-олигонуклеотидов на животных моделях и у человека несколько различаются, начавшиеся клинические испытания синтетических CpG-олигонуклеотидов позволяют рассматривать их как потенциальные адъюванты для опухолевых антигенов [27].

Белки теплового шока
Белки теплового шока (HSP) – это внутриклеточные молекулы, основная функция которых – катализация укладки полипептидов и контроль структуры белка. Количество HSP увеличивается в ответ на повреждающие воздействия различных факторов [62, 64]. С точки зрения создания противоопухолевых вакцин, ценно свойство HSP связываться с пептидами опухолевой клетки и фактически нести антигенный репертуар той клетки, из которой они получены [63]. На экспериментальных моделях установлено, что иммунизация HSP70, HSP90 и GP96, выделенными из опухолевых клеток, вызывает образование специфических цитолитических Т-лимфоцитов. Этого не наблюдалось при введении аналогичных белков, полученных из других тканей [64]. Другие белки этого семейства: Calreticulin, HSP110 и GRP170 – также могут использоваться в иммунотерапии рака [65, 66]. Предварительные данные клинических испытаний показали повышение числа опухолецифических цитолитических (CD8+) Т-лимфоцитов у большинства больных меланомой (IV стадия), иммунизированных белком GP96, полученным из аутологичных опухолевых клеток, что коррелировало с клиническим эффектом [67]. Вероятно, в механизме индукции HSP противоопухолевого иммунитета важную роль играют антигенпрезентирующие клетки, поскольку показана интернализация белков теплового шока путем эндоцитоза через CD91-рецептор, присутствующий на дендритных клетках. Доказано, что HSP принимают участие в образовании комплекса пептид – НLA I класса. Вероятно также, что эти белки являются индукторами созревания дендритных клеток и повышают экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости на них, костимулирующих молекул В7 и молекул межклеточной адгезии (ICAM-1). Это сопровождается индукцией синтеза провоспалительных цитокинов (GMCSF, IL-1, TNF). HSP могут влиять и на миграцию дендритных клеток [68]. Таким образом, белки теплового шока являются мощными эндогенными адъювантами и могут использоваться как в ассоциации с синтетическими антигенами, так в виде комплекса HSP-антиген, полученного из опухолевых клеток. Рекомбинантные НSP-молекулы используюся при создании fusion белков, когда продукция рекомбинантного гена, кодирующего как белок-активатор (HSP), так и опухолевый антиген, приводит к продукции fusion белков, состоящих из антигенного и активирующего компонентов.

Биологические модификаторы иммунного ответа
Биологические модификаторы иммунного ответа (IL-2, IL-4, IL-6 IL-12, IFN, GM-CSF и т.д.) часто вовлекаются в технологию производства вакцин или являются их составными компонентами. В простом варианте такие цитокины вводятся вместе с антигеном и стимулируют локальный иммунный ответ на него [69]. Однако существенные различия в фармакокинетике этих компонентов и прежде всего короткий период полужизни цитокинов не позволяют получить адекватного эффекта от такой комбинации. Поэтому чаще такие цитокины используются в составе ДНК-вакцин, и в этом случае одновременно экспрессируется выбранный иммуностимулирующий белок иногда совместно с опухолевым антигеном. Так, интрагуморальное введение плазмиды, кодирующей IL-2, IL-12 или ИНФa, вызывают длительное локальное повышение концентрации этих белков в опухоли. Это приводит к стимуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа и позволяет избежать токсичности, свойственной при системном введении таких препаратов [70].
В других случаях, с помощью рекомбинантных технологий опухолевые клетки больного трансфецируются генами цитокинов ex vivo и становятся способными их продуцировать. Комбинация опухолеассоциированных антигенов, представленных в форме живых, но смертельно облученных опухолевых клеток, в присутствии высоких местных концентраций цитокинов, продуцируемых этими же клетками, может существенно повысить иммунный ответ и привести к индукциии цитолитических Т-лимфоцитов прежде всего в месте инъекции вакцины и в дальнейшем в опухолевой ткани за счет миграции туда этих клеток. Однако помимо технических сложностей, связанных с получением материала от каждого больного, выведения клеточной линии, процедуры трансфекции, селекции трансфецированных клеток, связанных с наличием сложного оборудования и вспомогательных технологий, существуют сложности со стандартизацией полученного клеточного материала и длительностью процедуры (до месяца). Несколько упростить процедуру позволяет использование аллогенных стабильно-трансфецированных клеточных линий, которые могут вводиться больному отдельно или вместе с опухолевыми клетками, полученными от больного, или их лизатом. Поскольку, как уже говорилось ранее, проблема соответствия антигенного профиля клеток вакцины и опухолевых клеток больного существует, добавление туда опухолевого материала больного существенно исправляет этот недостаток. В этом случае аллогенные стабильно-трансфецированные клетки фактически выполняют роль лекарственной формы, длительно и стабильно повышающей локальную концентрацию цитокинов в месте присутствия антигена и, соответственно, стимулирующей иммунный ответ на него. Рекомбинантные вакцины с использованием различных цитокинов проходят клинические испытания уже несколько лет. В них используются, как правило, аллогенные и аутологичные опухолевые клетки или фибробласты, трансфецированные генами цитокинов [132]. Предпосылкой к включению в состав противоопухолевых вакцин IL-2 явились его известные противоопухолевые свойства и способность воздействовать на ключевые механизмы регуляции Т-клеточного иммунного ответа при системном введении. Применение аллогенных или аутологичных меланомных опухолевых клеток, трансфецированных геном IL-2, приводило к повышению числа специфических цитолитических Т-лимфоцитов у части больных, что в некоторых случаях сопровождалось клиническим эффектом [71–73]. Подобные результаты получены и при трансфекции этим геном аутологичных клеток у больных с колоректальной и почечной карциномой [74, 75]. В других экспериментальных и клинических исследованиях показано, что введение опухолевых клеток, трансфецированных геном GM-CSF, индуцирует мощный специфичный и длительный противоопухолевый иммунитет, коррелирующий с положительным клиническим эффектом при меланоме [76–79]. Начаты клинические испытания таких вакцин при раке почки, поджелудочной железы, простаты и др. [80–82]. Трансфецирование клеток почечной карциномы геном IL-4 вызывало выраженный иммунный ответ на них и сопровождалось развитием опухолеспецифичного иммунного ответа, опосредуемого CD8+ Т-клетками, которые были также активны и против опухолевых клеток, не экспрессирующих IL-4 [83]. Аллогенные меланомные клетки, секретирующие этот интерлейкин, также усиливают специфический Т-клеточный антимеланомный иммунный ответ [88]. Изучается возможность применения этого подхода при лечении меланомы с применением генов g-IFN, IL-6 и IL-12 [84–86].

Дендритные клетки
Как было отмечено ранее, ключевую роль в распознавании опухолевого антигена и презентации его специфическим цитолитическим Т-лимфоцитам играют дендритные клетки. Такие клетки можно рассматривать как мощный эндогенный адъювант, который при использовании его с опухолевым антигеном вызывает индукцию специфического иммунного ответа. Разработанные в последние годы методики получения дендритных клеток из моноцитов периферической крови, их костномозговых предшественников или стволовых клеток и их культивирования ex vivo позволили использовать эти клетки в качестве индукторов специфического противоопухолевого иммунного ответа в экспериментальных исследованиях и клинических испытаниях. Стандартная процедура включает получение незрелых дендритных клеток или их предшественников от больного, инкубацию их с ростовыми факторами (GM-CSF, IL-4), факторами, индуцирующими их созревание (TNF), и опухолевыми антигенами, что в конечном итоге приводит к формированию функционально полноценных антигенпрезентирующих клеток, которые вводятся больному. Таким образом, иммунный ответ на опухолевый антиген начинается in vitro, где достаточно точно можно контролировать количество и функциональное состояние антигенпрезентирующих клеток, а заканчивается в организме образованием специфических цитолитических CD8+ Т-лимфоцитов. Для примирования дендритных клеток часто используются лизированные опухолевые клетки, полученные от больного или из клеточной линии, апоптические тельца, содержащие набор неидентифицированных опухолевых антигенов. Применение этого подхода демонстрирует иммунологический и клинический эффект при метастатическом раке почки, меланоме и опухолях других локализаций [91, 92]. В качестве антигена также широко используются отдельные хорошо охарактеризованные пептиды. Так, при меланоме индукция иммунного ответа на отдельные синтетические антигены (МАGE-3, тирозиназу, gp100, Melan-A/MART), как правило, приводила к увеличению образования антигенспецифических цитолитических Т-лимфоцитов в периферической крови и опухолевой ткани, что сопровождалось регрессией метастазов [92–95]. При использовании простатспецифического антигена (PSA), простатспецифического мембранного антигена (PSMA), кислой фосфатазы (РАР) и дендритных клеток показано снижение уровня сывороточного простатспецифического антигена, что обычно коррелирует с интенсивностью опухолевого процесса [96]. В других исследованиях, показавших положительные результаты, в качестве антигена использовались белки вируса папилломы человека или вируса Эпштейна–Барр, мутантные онкопротеины bcr-abl, p53, RAS или гиперэкспрессированные антигены HER/2neu, CEA, muc-1 [97–101]. При миеломах и лимфомах используются фрагменты идиотипических антител. Так, случаи опухолевой регрессии наблюдались у пациентов с неходжкинской лимфомой и миеломой при использовании в качестве антигена идиотипических антител [102, 103]. Выраженными антигенпрезентирующими свойствами обладают дендритные клетки, для примирования которых применялся набор мРНК, выделенный из опухолевых клеток и отражающий спектр антигенов опухоли [104]. Кроме того, для примирования дендритных клеток может использоваться плазмидная ДНК, кодирующая отдельные опухолевые антигены, обычно с вирусным промотором [105, 106]. Ряд исследований посвящен fusion технологии, когда клетки, полученные путем слияния дендритных и опухолевых клеток, несут функции первых и отражают антигенный спектр вторых [107].
Существенным преимуществом этого вида вакцин является то, что в их составе отсутствуют адъюванты или иные стимуляторы иммунной системы, которые могут вызывать определенные побочные эффекты. В то же время не исключены аутоиммунные реакции при использовании неидентифицированных антигенов, которые могут включать не только опухолевые антигены, но и белки, присутствующие на нормальных клетках, а также супрессия ЦТЛ при использовании незрелых дендритных клеток [108, 109].
Достаточно сложная методика получения и манипуляций с дендритными клетками требует не только использования дорогого оборудования, реактивов и трудоемких методов производства, контроля и стандартизации, но и высококвалифицированного персонала, что существенно ограничивает их широкое применение. Безусловно, такие вакцины изготавливаются индивидуально и, соответственно, стоят дорого. Кроме того, требуется разработка критериев и параметров стандартизации как компонентов, применяемых в производстве вакцины, так и зрелых дендритных клеток. Отдельного рассмотрения требуют вопросы, регламентирующие клиническое применение таких препаратов.

Экзосомы
В качестве индукторов специфического иммунного ответа возможно использование не только целых дендритных клеток, примированных антигеном, но и их фрагментов. Так, экзосомы (маленькие, 60–100 нм, сферические пузырьки, формируемые клеткой для межклеточных взаимодействий), продуцируемые дендритными клетками, хорошо охарактеризованы и содержат все необходимые компоненты для активации иммунного ответа. Они стимулируют другие дендритные клетки, Т-лимфоциты, NK-клетки [110]. Экзосомы обладают следующими преимуществами по сравнению с дендритными клетками: меньшая вариация в параметрах и, соответственно, возможность получить более стандартизованный препарат; термостабильность и, соответственно, доступность для транспортировки. Положительным фактом является то, что белки, включаемые в состав экзосом, находятся в нативной, биологически активной конформации. Делаются попытки создания синтетических экзосом. При их производстве можно манипулировать содержанием белков и даже включать в их состав адъюванты. В ряде экспериментальных исследований такие экзосомы показали даже больший эффект по сравнению с дендритными клетками [110]. В доклинических исследованиях показано, что экзосомы, выделенные из опухолевых клеток, также обладают высокой способностью индуцировать специфический противоопухолевый иммунный ответ [111].

Лекарственные формы противоопухолевых вакцин
Особенности состава противоопухолевых вакцин, в которые могут входить целые опухолевые клетки или их лизаты, иммунокомпетентные клетки, пептиды, адъюванты, ДНК или РНК, вирусные компоненты и т.д., предопределяют особенности лекарственных форм и методов применения таких вакцин. Как лекарственная форма вакцины на основе синтетических антигенов и опухолевого лизата или пептида могут использоваться просто как раствор антигена и адъюванта или в более сложных системах доставки, например в инкапсулированной – липосомальной, гелевой и т.п. формах. Преимуществом инкапсулированных форм является медленный выход из них компонентов вакцины, что приводит к существенному увеличению иммунного ответа на них. Среди таких форм можно отметить этинил-винилацетатные липосомы, недеградируемые и деградируемые на основе биосовместимых полимеров – poly(DL-lactide-co-glycolide), демонстрирующие хорошие характеристики для создания вакцин [112]. Вероятно, перспективными могут быть имплантируемые системы в виде высоковязких жидкостей, полутвердых систем, вводимых через шприц, а также сложные формы, формирующие гелевую капсулу в месте введения [113]. В таких системах возможно сочетание антигенов и адъювантов, которые, изменяя свою фармакокинетику, могут использоваться в гораздо более низких дозах с увеличенным интервалом введения. Эффективность ДНК вакцин удается повысить при инъекции “голой ДНК” в эпидермис с помощью специального инжектора и при использовании в качестве носителя микроскопических частиц золота [114].

Клинические испытания противоопухолевых вакцин
Число клинических испытаний противоопухолевых вакцин за последние годы существенно увеличилось, и в настоящее время эффективность противоопухолевой вакцинации изучается в десятках клинических испытаний. К сожалению, во многом оптимизм иммунологов и полученные экспериментальные данные часто не подтверждаются реальными клиническими результатами и не оправдывают затраченных усилий. Вероятно, это связано с тем, что классические подходы, используемые для оценки клинического эффекта химиотерапевтических препаратов, во многом неприменимы для оценки противоопухолевых вакцин.
Первоначально клинические испытания противоопухолевых вакцин были начаты как классические I/II фазы клинических испытаний у пациентов с продвинутой формой заболевания, резистентой к стандартному лечению (химиотерапии) при метастатических опухолях, таких как меланома. Традиционно задачей первой фазы клинических испытаний для цитотоксических препаратов является определение максимально переносимой дозы (МПД). Согласно классической методике МПД определяется путем эскалации доз на малом числе пациентов, что не дает возможности оценить противоопухолевую активность препарата. Однако в случае противоопухолевых вакцин ценность I фазы клинических испытаний невысока, поскольку при использовании противоопухолевых вакцин нет прямой зависимости между дозой вакцины и ее эффектом. В силу этого применение высоких доз не является оправданным, и дозы, используемые в клинике, всегда существенно ниже максимально переносимых. В большинстве проведенных испытаний противоопухолевых вакцин МПД не достигалась вообще. Это связано с тем, что токсичные дозы лежат за пределами тех возможностей, которые существуют, скажем, для получения достаточно большого числа опухолевых, аутологичных дендритных клеток, дефективных рекомбинантных вирусов или рекомбинантных (или синтетических) белковых опухолевых антигенов. С точки зрения манипуляции дозами, важнее оценить зависимость иммунологического эффекта от вводимой дозы и определить тот диапазон доз и режимы применения, которые вызывают максимальный иммунный ответ, т. е. определить оптимальную биологически активную дозу. Однако определить такую оптимальную биологически активную дозу на минимальном числе пациентов при I фазе клинических испытаний представляется невозможным, поскольку для каждой дозы и режима применения требуется достаточное количество наблюдений. Оценка какой-либо клинической эффективности является задачей II фазы клинических испытаний, и на практике иногда I и II фазы клинических испытаний сочетаются. Из других аспектов безопасности при клинических испытаниях противоопухолевых вакцин следует отметить, что их побочные эффекты являются своеобразными. Из них можно выделить аутоиммунные реакции, которые возможно рассматривать и как маркеры эффективности (например, витилиго при применении антимеланомных вакцин) или реакции по типу трансплантационного иммунитета, при использовании аллогенного материала. Кроме того, во внимание должен быть принят и тот факт, что в некоторых случаях применение противоопухолевых вакцин может вызывать даже прогрессию опухоли вследствие индукции толерантности к опухолевым антигенам.
В отношении оценки клинического эффекта при использовании противоопухолевых вакцин следует отметить следующее. Классические показатели противоопухолевой активности, применяемые для оценки цитостатиков, такие как регрессия опухоли, стабилизация процесса или задержка развития опухоли, могут применятся при оценке эффективности противоопухолевых вакцин с пониманием того, что в отличие от химиотерапевтических препаратов, действующих прямо на опухолевые клетки и вызывающих значимый клинический эффект уже через 2–4 нед, вакцины действуют опосредованно, индуцируя клеточный иммунный ответ, максимальный уровень которого может наблюдаться гораздо позже, даже через месяцы от начала вакцинации, тогда как в начале использования специфической иммунотерапии увеличение опухолевой массы возможно. Хотя химиотерапевтические средства могут вызывать гибель опухолевых клеток в короткие сроки от начала введения, клинический эффект может длиться всего несколько недель. В отношении противоопухолевых вакцин этот период составляет от нескольких месяцев до нескольких лет [115]. Важным фактором, определяющим эффективность вакцинации, является и размер опухоли, поскольку существует некоторое критичное соотношение между количеством опухолевых клеток и эффекторных цитолитических Т-лимфоцитов, способных элиминировать опухолевые клетки. При большой опухолевой массе такое эффективное соотношение и, соответственно, клинический эффект труднодостижимы. Для получения адекватных результатов важен выбор пациентов и стадии заболевания. Поэтому необходима разработка и критериев отбора больных для вакцинотерапии. Так, пациенты с продвинутым опухолевым процессом являются далеко не идеальными кандидатами для вакцинотерапии. Вероятно, будущие исследования должны быть сосредоточены на пациентах с минимальными клиническими признаками заболевания. Гетерогенность опухолевого генотипа может также затруднять интерпретацию клинического эффекта. Так, генетическая нестабильность опухолевых клеток и присутствие гетерогенных клонов в одной опухолевой массе, экспрессирующих и не экспрессирующих (или экспрессирующих другие) опухолевые антигены, может быть отражена и в результате применения противоопухолевых вакцин, когда одни метастазы исчезают или существенно регрессируют, а другие могут и прогрессировать. Это может потребовать применения вакцинации с другими антигенами.
Оценка клинического эффекта противоопухолевой вакцинации, безусловно, должна сочетаться с лабораторной оценкой уровня специфического противоопухолевого иммунного ответа, который является базовым показателем эффективности вакцинации. Однако такая оценка связана с определенными методологическими и концептуальными трудностями. В клинике применяются различные методы иммуномониторинга при использовании противоопухолевых вакцин. Хотя уровень антител к опухолевым антигенам не является производным от функции Т-лимфоцитов, значение этого показателя для оценки эффективности вакцинации оценивалось в ряде исследований [116–118]. В них показано, что повышение уровня специфических антител (IgG, IgM) сопровождается клиническим эффектом, который может опосредоваться как собственно антителами, так и, возможно, через Т-лимфоциты, поскольку в некоторых исследованиях показана корреляция между уровнем антител и образованием ЦТЛ [119]. Показано, что гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) коррелирует с содержанием антигенспецифических Т-лимфоцитов при вакцинации с HER/2-neu и клиническим эффектом при использовании аутологичного лизата меланомных клеток [120, 122]. Более точные методы оценки прямого действия ЦТЛ на опухолевые клетки по выходу радиоактивного хрома или с использованием флюориметрических или колориметрических методов применимы для экспериментальных исследований, но имеют ограничения для использования в клинической практике. Ряд методов основан на оценке экспрессии некоторых молекул на Т-лимфоцитах (зета-цепь CD3-рецептора) или их способности секретировать цитокины [119, 123, 124]. Показано, что у больных с клинически эффективной иммунизацией аутологичными клетками стимуляция Т-лимфоцитов анти-СD3 моноклональными антителами вызывает повышенную секрецию цитокинов (IL-4, GM-CSF, з-IFN), и это может быть одним из критериев оценки эффективности иммунизации [123, 124]. Обычно уровень цитокинов определяется иммуноферментным методом в надосадочной жидкости при культивировании лимфоцитов периферической крови. Однако более чувствительным (в 10–200 раз) является оценка продукции цитокинов методом ELISPOТ [125]. С помощью этого метода возможна визуальная оценка секреции цитокинов отдельной клеткой с помощью меченных энзимом антител (подобно ИФА). Инкубация полученных от больного лимфоидных клеток с используемым для вакцинации антигеном приводит к повышению секреции цитокинов только сенсибилизированными клетками, что позволяет количественно оценить содержание антигенспецифических Т-лимфоцитов. Чувствительность, воспроизводимость и специфичность этого метода позволили использовать его для оценки эффективности противоопухолевой вакцинации во многих исследованиях [126–128]. Оценка иммунного ответа по повышению внутриклеточного уровня цитокинов возможна и методом проточной цитофлюориметрии, что использовалось при иммунизации эпитопами меланомных белков, MUC-1, и идиотипическими антителами при меланоме [129–131]. RT-PCR также может использоваться для оценки уровня транскрипции генов цитокинов (что возможно при активации сенсибилизированных Т-лимфоцитов), коррелирующего с повышением уровня цитокинов, который определяется описанными методами при иммунизации меланомными антигенами [133]. С помощью тетрамерного комплекса МНС (обычно рекомбинантного происхождения)+пептид, меченного флюоресцентной меткой, который связывается с MHC/пептидспецифическим Т-клеточным рецептором, также возможно определить количество антигенспецифических Т-клеток, хотя некоторые исследования не подтвердили клинического значения этого метода [134, 135].
В то же время иммуномониторинг при противоопухолевой вакцинации не является рутинным исследованием, и его ценность зависит от качества исследований, доступности достаточного количества материала для проведения достоверного анализа. Анализ должен быть специфическим, воспроизводимым и достаточно чувствительным для оценки иммунного ответа в отношении конкретной опухоли. При разработке методов иммуномониторинга важно оценить вариабельность результатов исследуемого показателя: в норме (у здоровых людей), вариабельность результатов у каждого больного в разные моменты времени, вариабельность результатов среди разных больных. Кроме того, важными вопросами при применении противоопухолевой вакцинации являются следующие. Как можно интерпретировать развитие иммунного ответа на используемый опухолевый антиген без клинического эффекта? Как можно интерпретировать клинический эффект без отсутствия такого иммунного ответа? Как интерпретировать отсутствие иммунного ответа и клинического эффекта? Такие варианты достаточно часто встречаются при применении вакцинотерапии. Безусловно, необходимо определение иммунного статуса больных перед иммунизацией, что также может помочь в выборе пациентов для включения в клинические испытания и при интерпретации результатов иммунизации. Клинические испытания, возможно, должны также включать и позитивный контроль с неопухолевым антигеном, хотя такого стандартного позитивного контроля (антигена) пока не существует.
Хотя многочисленные экспериментальные и клинические данные показывают эффективность противоопухолевой вакцинации, в некоторых случаях повышение количества и активности антигенспецифических Т-лимфоцитов не коррелирует с клиническим эффектом. Вероятно, что одной из причин, существенно снижающих эффективность противоопухолевой вакцинации, является продукция опухолевыми клетками иммуносупрессивных факторов, вызывающих анергию и даже апоптоз Т- лимфоцитов. Поэтому важно оценивать и учитывать продукцию опухолевыми клетками иммуносупрессивных факторов, влияющих на развитие противоопухолевого иммунного ответа, поскольку применение средств, блокирующих эти факторы, может увеличить эффективность вакцинотерапии. Показано, что при некоторых опухолях наблюдается повышение уровня IL-10, вероятно, опосредуемое TFG-b, уровень которого в этом случае также повышается [136]. По этой причине применение препаратов, снижающих продукцию таких факторов моноклональных антител или антисенс олигонуклеотидов, является целесообразным вместе с противоопухолевой вакцинацией [137, 138]. Применение ингибиторов циклооксигеназы-2 (аспирин и некоторые другие нестероидные противовоспалительные препараты) может приводить к снижению опухолевыми клетками продукции простагландина Е2, который обладает как самостоятельным иммуносупрессивным действием, так и повышает продукцию IL-10, снижая при этом продукцию IL-12 макрофагами [139]. Повысить эффективность противоопухолевой вакцинации можно и модифицируя некоторые регуляторные взаимодействия между клетками иммунной системы. Так, блокада CTLA-4 Т-клеточного рецептора усиливает иммунный ответ на опухолевые антигены. Этот рецептор, как и СD28, связывается с В7.1 и В7.2 молекулами дендритных клеток, обладая при этом большей аффинностью подавлять Т-клеточный иммунный ответ. В экспериментальных исследованиях показано, что применение анти-CTLA-антител существенно усиливает иммунный ответ, что коррелирует с противоопухолевым эффектом. Начаты клинические испытания таких антител совместно с вакцинацией против меланомы, рака яичников и простаты [140, 141].

Заключение
Исторически вакцинотерапия рака отражает различные уровни понимания иммунного ответа. Почти век назад исследователи иммунизировали больных живыми или лизированными опухолевыми клетками. После 1960 г. акцент в исследованиях был сделан на адъюванты, смешиваемые с опухолевыми клетками. Последние 25 лет в вакцинотерапию включали различные виды идентифицированных опухолевых антигенов, а также цитокины. Безусловно, в дальнейшем фундаментальные исследования, связанные с раскрытием механизмов развития противоопухолевого иммунного ответа, и новые технологические решения позволят разработать более эффективные и универсальные средства специфической иммунотерапии опухолей. Дальнейший прогресс вакцинотерапии опухолей связан с расширением спектра идентифицированных опухолевых антигенов, созданием их иммуногенных форм. Перспективы этого метода зависят и от создания новых, более мощных адъювантов, изучения их механизма действия. Важно понимание функций и механизмов действия цитокинов, используемых в противоопухолевой вакцинотерапии. При создании генно-инженерных вакцин необходимо совершенствование методов трансфекции и выбора необходимых векторных систем. Задачей будущих исследований является разработка систем доставки лекарственных форм, обеспечивающих формирование максимального уровня иммунного ответа. Применение вакцинотерапии требует также и индивидуального подхода к лечению каждого больного. Это касается прежде всего оценки антигенного профиля опухоли и антигенов главного комплекса гистосовместимости. Необходимым является разработка доступных методов мониторинга эффективности вакцинации.
Настоящее состояние специфической иммунотерапии опухолей можно определить как завершение того начального периода, когда необходимо было доказать возможность ее применения в онкологии. Уже сейчас показаны положительные результаты от ее применения при лечении опухолей многих видов. Это сочетается с относительной безопасностью метода, что контрастирует с выраженными побочными эффектами химиотерапии. Некоторые противоопухолевые вакцины в настоящее время завершают III фазу клинических испытаний, и уже в недалеком будущем активная иммунотерапия станет стандартным методом и частью комплексного лечения рака.

Литература
1. Boon T, Van der Bruggen P. J Exp Med 1996; 183 (3): 725–9.
2. Corman JM, Sercarz EE, Nanda NK. Clin Exp Immunol 1998; 114: 166–72.
3. Houghton AN. J Exp Med 1994; 180: 1.
4. Kawashima I, Tsai V, Southwood S et al. Cancer Res 1999; 59: 431.
5. Butterfield LH, Koh A, Meng W et al. Cancer Res 1999; 59: 3134.
6. Minev B, Hipp J, Firat H et al. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 4796.
7. Van der Bruggen P, Traversari C, Chomex P et al. Science 1991; 254: 1643.
8. Carubia JM, Yu RK, Macala LJ et al. Biochem Biophys Res Commun 1984; 120: 500.
9. Robbins PF, El-Gamil M, Li YF et al. J Exp Med, 1996; 183: 1185.
10. Wolfel T, Hauer M, Schneider J et al. Science 1995; 269: 1281.
11. Dermime S, Bertazzoli C, Marchesi E et al. Clin Cancer Res 1996; 2: 593.
12. Jansen-Durr P, Tommasino M. Landes Bioscience, Austin/USA 1997; 103–36.
13. Duraiswamy J, Sherritt M, Thomson S et al. Blood, 2003; 101 (8): 3150–6.
14. Chapman PB, Morrisey D, Panageas KS et al. Clin Cancer Res 2000; 6 (12): 4658–62.
15. Portoukalian J, Carrel S, Dore JF et al. Int J Cancer 1991; 49: 893.
16. Scanlan MJ, Gure AO, Jungbluth AA et al. Immunol Rev 2002; 188: 22–32.
17. Peterson AC, Harlin H, Gajewski TF. J Clin Oncol 2003; 21 (12): 2342–8.
18. Ragupathi G, Livingston P. Expert Rev Vaccines 2002; 1 (2): 193–206.
19. Campbell MJ, Esserman L, Byars NE et al. J Immunol 1990; 145: 1029–36.
20. Stevenson FK, Gordon J. J Immunol 1983; 130: 970–3.
21. Hsu FJ, Caspar CB, Czerwinski D et al. Blood 1997; 89: 3129–35.
22. Davis TA, Hsu FJ1, Caspar CB. Biol Blood Marrow Transplant 2001; 7: 517–22.
23. Liso A, Stockerl-Goldstein KE, Auffermann-Gretzinger S et al. Biol Blood Marrow Transplant 2000; 6 (6): 621–7.
24. Bhattacharya-Chatterjee M, Chatterjee SK, Foon KA. Immunol Lett 2000; 74: 51–8.
25. Wagner U, Schlebusch H, Kohler S et al.
26. Foon KA, Sen G, Hutchins L et al. Clin Cancer Res 1998; 4 (5): 1117–24.
27. Rothenfusser S, Tuma E, Wagner M et al. Curr Opin Mol Ther 2003; 5 (2): 98–106.
28. Birebent B, Koido T, Mitchell E et al. J Cancer Res Clin Oncol 2001; 127 (2): 27–33.
29. Wolff JA, Malone RW, Williams P et al. Science 1990; 247: 1465–68.
30. Rosenberg SA et al. J Natl Cancer Inst 1998; 90: 1894–900.
31. Marshall JL et al. J Clin Oncol 2000; 23: 3963–73.
32. Eder JP et al. Clin Cancer Res 2000; 5: 1632–8.
33. Fisher RI, Terry WD, Hodes RJ et al. Surg Clin North Am 1981; 61: 1267–77.
34. Klencke B, Matijevic M, Urban RG et al. Clin Cancer Res 2002; 8:1028–37.
35. Ribas A, Butterfield LH, Economou JS. Oncologist 2000; 5: 87–98.
36. Berd D. Expert Opin Biol Ther 2002; 2 (3): 335–42.
37. Morton DL, Hoon DS, Nizze JA et al. Ann N Y Acad Sci 1993; 690: 120.
38. Hoon DSB, Yuzuki D, Hayashida M et al. J Immunol 1995; 154: 730Р–737.
39. Sosman JA, Sondak VK.
40. Mitchell MS. Semin Oncol 1998; 25: 623–35.
41. Sondak VK, Liu PY, Tuthill RJ et al. J Clin Oncol 2002; 20: 2058–66.
42. Wallack MK, Sivanandham M, Balch CM et al. J Am Coll Surg 1998; 187: 69–79.
43. Musselli C, Livingston PO, Ragupathi G. J Cancer Res Clin Oncol 2001; 127 (2): 20–6.
44. Hernando JJ, Park TW, Kubler K et al. Cancer Immunol Immunother 2002; 51 (1): 45–52.
45. Goodenow RS, Vogel JM, Linsk RL. Science (Wash. DC) 1985; 230: 777–83.
46. Stopeck AT, Jones A, Hersh EM et al. Clin Cancer Res 2001; 7 (8): 2285–91.
47. Diaz A, Alfonso M, Alonso R et al. Clin Immunol 2003; 107 (2): 80–9.
48. Smith JW 2nd, Walker EB, Fox BA et al. J Clin Oncol 2003; 21 (8): 1562–73.
49. Slingluff CL Jr, Yamshchikov G, Neese P et al. Clin Cancer Res 2001; 7 (10): 3012–24.
50. Yamshchikov GV, Barnd DL, Eastham S et al. Int J Cancer 2001; 92 (5): 703–11.
51. Van Driel WJ, Ressing ME, Kenter GG et al. Eur J Cancer 1999; 35 (6): 946–52.
52. Kim SK, Ragupathi G, Musselli C et al. Vaccine 1999; 18 (7–8): 597–603.
53. Chang AE, Li Q, Jiang G et al. J Clin Oncol 2003; 21 (5): 884–90.
54. Hsueh EC, Essner R, Foshag LJ et al. Ann Surg Oncol 2002; 9 (5): 486–92.
55. Baars A, Claessen AM, van den Eertwegh AJ et al. Ann Oncol 2000; 11 (8): 965–70.
56. Harris JE, Ryan L, Hoover HC Jr et al. J Clin Oncol 2000; 18 (1): 148–57.
57. Ito T, Okabayashi M, Osada Y et al. In Vivo 1988; 2 (5): 325–9.
58. Batliwalla FM, Bateman BA, Serrano D et al. Mol Med 1998; 4 (12): 783–94.
59. Wallack MK, Sivanandham M. Ann N Y Acad Sci 1993; 690: 178.
60. Wallack M, Sivanandham M, Balch CM et al. Cancer 1995; 75: 34.
61. Hersey P, Coates AS, McCarthy WH et al. J Clin Oncol 2002; 20 (20): 4181–90.
62. Gething MJ, Sambrook J. Nature 1992; 355: 33–45.
63. Tamura Y, Peng P, Liu K et al. Science 1997; 278: 117–20.
64. Udono H, Srivastava PK. J Immunol 1994; 152: 5398–403.
65. Basu S, Srivastava PK. J Exp Med 1999; 189: 797–802.
66. Wang XY et al. J Immunol 2001; 166: 490–7.
67. Belli F, Testori A, Rivoltini L et al. J Clin Oncol 2002; 20 (20): 4169–80.
68. Basu S et al. Immunity 2001; 14: 303–13.
69. Hunger RE, Brand CU, Streit M et al. Exp Dermatol 2001; 10 (3): 161–7.
70. Hoffman DM, Figlin RA. World J Urol 2000; 18: 152–6.
71. Osanto S, Schiphorst PP, Weijl NI et al. Hum Gene Ther 2000; 11 (5): 739–50.
72. Palmer K, Moore J, Everard M et al. Hum Gene Ther 1999; 10 (8): 1261–8.
73. Schreiber S, Kampgen E, Wagner E et al. Hum Gene Ther 1999; 10 (6): 983–93.
74. Sobol RE, Shawler DL, Carson C et al. Clin Cancer Res 1999; 5 (9): 2359–65.
75. Veelken H, Mackensen A, Lahn M et al. Int J Cancer 1997; 70 (3): 269–77.
76. Dranoff G, Jaffee E, Lazenby A et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 3539.
77. Chang AE, Li Q, Bishop DK et al. Hum Gene Ther 2000; 11 (6): 839–50.
78. Kusumoto M, Umeda S, Ikubo A et al. Cancer Immunol Immunother 2001; 50 (7): 373–81.
79. Soiffer R, Lynch T, Mihm M, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 13141–6.
80. Simons JW, Jaffee EM, Weber CE et al. Cancer Res 1997; 57 (8): 1537–46.
81. Jaffee EM, Hruban RH, Biedrzycki B et al. Clin Oncol 2001; 19 (1): 145–56.
82. Simons JW, Mikhak B, Chang JF et al. Cancer Res 1999; 59 (20): 5160–8.
83. Golumbek PT, Lazenby AJ, Levitsky HI et al. Science 1991; 254: 713.
84. Abdel-Wahab Z, Weltz C, Hester D et al. Cancer 1997; 80: 401.
85. Mackiewicz A, Gorny A, Laciak M et al. Hum Gene Ther 1995; 6: 805.
86. Sun Y, Jurgovsky K, Moller P et al. Gene Ther 1998; 5 (4): 481–90.
87. Briones J, Timmerman JM, Panicalli DL et al. J Natl Cancer Inst 2003; 95 (7): 548–55.
88. Arienti F, Belli F, Napolitano F et al. Hum Gene Ther 1999; 10 (18): 2907–16.
89. Sanda MG, Smith DC, Charles LG et al. Urology 1999; 53 (2): 260–6.
90. Hodge JW, Grosenbach DW, Aarts WM et al. Clin Cancer Res 2003; 9 (5): 1837–49.
91. Holtl L, Zelle-Rieser C, Gander H et al. Clin Cancer Res 2002; 8 (11): 3369–76.
92. Nestle FO, Alijagic S, Gilliet M et al. Nat Med 1998; 4: 328 Р32.
93. Thurner B, Haendle I, Roder C et al. J Exp Med 1999; 190: 1669 Р78.
94. Mackensen A, Herbst B, Chen J-L et al. Int J Cancer 2000; 86: 385 Р92.
95. Panelli MC, Wunderlich J, Jeffries J et al. J Immunother 2000; 23: 487 Р98.
96. Murphy GP, Tjoa BA, Simmons SJ et al. Prostate 1999; 38: 73 Р8.
97. Da Silva DM, Eiben GL, Fausch SC et al. J Cell Physiol 2001; 186: 169–82.
98. Redchenko IV, Rickinson AB. J Virol 1999; 73: 334 Р42.
99. Bickham K, Munz C, Larsson M et al. J Clin Invest 2001; 107: 121 Р30.
100. Brossart P, Wirths S, Stuhler G et al. Blood 2000; 96: 3102 Р8.
101. Morse MA, Deng Y, Coleman D et al. Clin Cancer Res 1999; 5: 1331 Р8.
102. Liso A, Stockerl-Goldstein KE, Auffermann-Gretzinger S et al. Biol Blood Marrow Transplant 2000; 6: 621 Р7.
103. Lim SH, Bailey-Wood R. Int J Cancer 1999; 83: 215 Р22.
104. Boczkowski D, Nair SK, Snyder D et al. J Exp Med 1996; 184: 465–72.
105. Morse MA, Lyerly HK. World J Surg 2002; 26 (7): 819–25.
106. Smith SG, Patel PM, Porte J et al. Clin Cancer Res 2001; 7 (12): 4253–61.
107. Kugler A, Stuhler G, Walden P et al. Nat Med 2000; 6: 332–6.
108. Dhodapkar MV, Steinman RM, Krasovsky J et al. J Exp Med 2001; 193: 233–8.
109. Jonuleit H, Schmitt E, Schuler G et al. J Exp Med 2000; 192: 1213–22.
110. Amigorena S. Medicina (B Aires) 2000; 60 (2): 51–4.
111. Andre F, Schartz NE, Chaput N. Vaccine 2002; 20 (4): 28–31.
112. Chandrashekar G, Udupa N. J Pharm Pharmacol 1996; 48: 669–74.
113. Haglund BO, Josi R, Himmelstein KJ. J Control Rel 1996; 41: 29–35.
114. Restifo NP, Ying H, Hwang L et al. Gene Ther 2000; 2: 89–92.
115. Chan AD, Morton DL. Semin Oncol 1998; 25: 611 Р622.
116. Hsueh EC, Gupta RK, Qi K et al. J Clin Oncol 1998; 16: 2913 Р20.
117. Takahashi T, Johnson TD, Nishinaka Y et al. J Invest Dermatol 1999; 112: 205 Р9.
118. Richards ER, Devine PL, Quin RJ et al. Cancer Immunol Immunother 1998; 46: 245 Р52.
119. Gratama JW, Zea AH, Bolhuis RL et al. Cancer Immunol Immunother, 1999; 48: 263 Р9.
120. Disis ML, Schiffman K, Gooley TA et al. Clin Cancer Res 2000; 6 (4): 1347–50.
121. Ulanova M, Tarkowski A, Hahn-Zoric M et al. Infect Immun 2001; 69 (2): 1151–9.
122. Berd D, Maguire HC Jr, McCue P, Mastrangelo MJ et al. Department of Medicine, University of Philadelphia PA 19107.
123. Kim J, Bresler H, Martin EJ et al. Cancer 1999; 86: 22 Р30.
124. Li Q, Normolle D, Sayre D et al. Clin Immunol 2000; 94: 64 Р72.
125. Miyahira Y, Murata K, Rodriguez D et al. J Immunol Methods 1995; 181: 45 Р54.
126. Arlen P, Tsang KY, Marshall JL et al. Cancer Immunol Immunother 2000; 49: 517 Р29.
127. Bennouna J, Hildesheim A, Chikamatsu K et al. J Immunol Methods 2002.
128. Nagorsen D, Keilholz U, Rivoltini L et al. Cancer Res 2000; 60: 4850 Р4.
129. Lee PP, Yee C, Savage PA et al. Nat Med 1999; 5: 677 Р85.
130. Maecker HT, Auffermann-Gretzinger S, Nomura LE et al. Clin Cancer Res 2001; 7: 902 Р8.
131. Karanikas V, Lodding J, Maino VC et al. Clin Cancer Res 2000; 6: 829 Р37.
132. Sobol RE, Royston I, Fakhrai H, et al. Hum Gene Ther 1995; 6: 195.
133. Kammula US, Marincola FM, Rosenberg SA. J Natl Cancer Inst 2000; 92: 1336 Р44.
134. Lee KH, Wang E, Nielson MB et al. J Immunol 1999; 163: 6292 Р6300.
135. Lee P,Wang F, Kuniyoshi J et al. J Clin Oncol 2001; 19: 3836 Р47.
136. Maeda H, Shiraishi A. J Immunol 1996; 156: 73 Р8.
137. Fakhrai H, Dorigo O, Shawler DL et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 2909–14.
138. Gorelik L, Flavell RA. Nat Med 2001; 7: 1118–22.
139. Huang M, Stolina M, Sharma S et al. Cancer Res 1998; 58: 1208–16.
140. Allison JP. Cancer Immunity 2003; 3 (1): 20.
141. Hodi FS, Mihm MC, Soiffer RJ et al. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100 (8): 4712–7.
http://www.consilium-medicum.com/