Разработан гибридный пептид TPR ориентации Hsp90 в качестве нового противоракового средства
Tomohisa Horibe , Масаюки Коно , Мари Haramoto , Кодзи Охара и Кодзи Каваками
Департамент фармакоэпидемиологии, Высшая школа медицины и общественного здравоохранения, Университет Киото, Йошида Konoecho, Sakyo-ку, Киото, 606-8501, Япония
автор электронной почте соответствующее электронной почты автора

Журнал Поступательное медицины 2011 года, 9 : 8 DOI: 10.1186/1479-5876-9-8

Электронная версия данной статьи является полное одну и можно найти в Интернете по адресу: http://www.translational-medicine.com/content/9/1/8

Поступило в редакцию: 14 октября 2010
Принято редколлегией: 14 января 2011
Опубликовано: 14 января 2011
© 2011 Horibe и др.; лицензиат BioMed Central ООО
Это Открытого статье доступа распределенной в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution ( http://creativecommons.org/licenses/by/2.0 ), что позволяет неограниченное использование, распространение, и воспроизводства на любом носителе, при условии, оригинальная работа правильно цитируется.

Абстрактный

Фон
Несмотря на постоянно совершенствующихся понимание молекулярной биологии рака, лечение большинства раковых заболеваний не изменилась в течение последних трех десятилетий, и препараты, которые не делают различий между опухолевыми клетками и нормальные ткани остаются опорой противоопухолевой терапии. Так как Hsp90, как правило, участвуют в пролиферации и выживания, это как полагают, играет ключевую роль в рак, и Hsp90 вызвало значительный интерес в последние годы в качестве потенциальной терапевтической мишени.

Методы
Мы сосредоточили свое внимание на взаимодействии Hsp90 с белком p60/Hop кофактора, и спроектирован клеточной проницаемой пептидомиметик, называемые "гибридные Antp-TPR пептид", по образцу обязательным интерфейс между молекулярными шаперона Hsp90 и домен TPR2A хмеля.

Результаты
Было показано, что эта разработана гибридная Antp-TPR пептид ингибирует взаимодействие Hsp90 с доменом TPR2A, вызывая гибель клеток рака молочной железы, поджелудочной железы, почек, легких, простаты и рака желудка клеточных линий в пробирке . В противоположность этому, Antp-TPR пептида не влияют на жизнеспособность нормальных клеток. Более того, анализ в естественных условиях показало, что Antp-TPR пептид отображается значительные противоопухолевую активность в ксенотрансплантата модели человеческого рака поджелудочной железы у мышей.

Заключение
Эти результаты показывают, что Antp-TPR пептида даст мощный и селективный противоопухолевой терапии онкологических больных.

Фон

Тепло-шока 90 (Hsp90) является молекулярный шаперон [ 1 ], что участвует в контроле качества сворачивания белка. Механизм действия Hsp90 включает последовательные циклы АТФазы и ступенчатый набор cochaperones, в том числе Hsp70, CDC37, p60/Hsp-organizing белка (Hop) и p23[ 2 , 3 ]. В частности, Hsp90 и Hsp70 взаимодействует с многочисленными кофакторов содержащие так называемые tetratricopeptide повторить (TPR) областях. TPR доменов состоит из свободно сохраняется 34-аминокислотной последовательности мотивов, которые повторяются от одного до 16 раз для каждого домена. Первоначально, определенных в компонентах анафазе способствующих комплекс[ 4 , 5 ], TPR областях, как известно, посредником специфические взаимодействия белков в различных контекстах сотовых[ 6 - 8 ]. Более того, кроме от отбывания просто якорь функций, TPR области хип шаперона кофакторов и p60/Hop также способен регулировать АТФазы деятельности Hsp70 и Hsp90, соответственно[ 9 , 10 ]. Каждый 34-аминокислота мотив образует пару антипараллельных α -спиралей. Эти мотивы расположены в тандеме массива в сверхспирализации структуру, которая охватывает центральные канавки. TPR-домен-содержащих кофакторами Hsp70/Hsp90 мульти-шаперонов системы взаимодействуют с С-концевых участков Hsp70 и Hsp90[ 11 ]. Исследования с участием удаления мутагенеза предположили, что С-концевой последовательности мотив EEVD-COOH, который высоко сохраняется во всех Hsp70s и Hsp90s из эукариотических цитозоле, играет важную роль в TPR-опосредованной кофактора обязательных[ 12 ]. Хоп служит адаптер белка Hsp70 и Hsp90[ 13 , 14 ], оптимизации их функционального сотрудничества[ 15 ], не сама выступает в качестве молекулярного шаперона[ 16 ], и содержит три TPR доменов, каждый из которых содержит три мотивы TPR[ 17 ]. N-терминал TPR области хоп, TPR1, в частности, признается, С-концевой семь аминокислот Hsp70 (PTIEEVD), тогда как TPR2A признает С-концевой пять остатков Hsp90 (MEEVD)[ 17 ].

Hsp90 имеет ограниченный репертуар клиента белков, например, несколько киназ, среди других белков, которые связываются с Hsp90 для правильного созревания, и Hsp90, как правило, участвуют в пролиферации и выживания [ 2 , 3 ]. Это как полагают, играет ключевую роль в рак[ 18 - 20 ], в которых стресс-реакция признания Hsp90 может способствовать опухолевых клеток адаптации в неблагоприятных средах[ 21 ]. Понимание этого пути создала жизнеспособный терапевтические возможности[ 22 ], и молекулярные адресности Hsp90 АТФазы классом антибиотиков ansamycin прототипически примере гелданамицина[ 23 ] показал, перспективных противоопухолевой активности, отключив несколько сигнальных сетей, необходимых для опухолевых клеток обслуживание[ 24 ]. Хотя многие Hsp90 ориентированных соединений в настоящее время изучаются для противоопухолевого терапевтический потенциал, молекулярный механизм их противоопухолевой активности, пока неясно. В последнее время Gyurkocza и др. . сообщил Роман антагонист пептидил взаимодействия между Hsp90 и сурвивина, и назначил его "shepherdin"[ 25 , 26 ]. Сурвивина является членом ингибитор апоптоза семья ген[ 27 ], и участвует в контроле митоза и подавление апоптоза или гибель клеток[ 28 ]. Показано, что shepherdin делает широкие контакты с карманного АТФ Hsp90, дестабилизирует его белков клиента, и вызывает массовую гибель раковых клеток от апоптоза и nonapoptotic механизмов. Поразительно, shepherdin не снижает жизнеспособность нормальных клеток[ 25 , 26 ]. Эти результаты показывают, что не только небольшие соединения, но и пептиды ориентации Hsp90 даст мощный избирательности противоопухолевого в рак подшипников хоста.

В этом исследовании мы разработали новый гибридный пептид, состоящий из клеточной мембраны, проникать и Hsp90 ориентированных последовательностей. Структура основе мимики нарушить взаимодействие между Hsp90 и домен TPR2A хмеля было продемонстрировано, как и эффективностями в пробирке и в естественных условиях этого пептида препарата против рака.

Методы

Материалы
Анти-Hsp90 и анти-Hsp70 антител, человеческий рекомбинантный Hsp90 α , и хоп (p60), были приобретены у Bioreagents Stressgen. Анти-Akt и анти-CDK4 антитела были приобретены у клеточной сигнализации. Анти-сурвивина антител был приобретен у компании Thermo Scientific. Человеческий рекомбинантный FKBP5 и PP5 были приобретены у Abnova. Anti- β -актин антител и человеческого рекомбинантного Hsp70 были приобретены у SIGMA. Все реагенты были реагента класса качества.

Процедить и плазмиды
Кишечной палочки AD494 (DE3) { Δ ара , лей 7697, Δ лак X74, Δ фотонов , Pvu II, Пхо R, Δ мал F3, F '[ лак - , ( LacI д ), про ], TRX B:: кан (DE3)} и ПЭТ-15b (Novagen Inc) были использованы для выражения домена TPR2A из человека-хопа.

Клеточные культуры
Следующие человеческой опухоли и нормальные клеточные линии были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС): рака молочной железы человека (BT-20, T47D, и MDA-MB-231), рак легких (A549), рак почки (Caki-1 ), рак предстательной железы (LNCaP), рак желудка (OE19) и легких фибробластов (MRC5). Человеческого рака поджелудочной железы клеточной линии (BXPC3) был приобретен у европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС). Человека эмбриональные линии клеток почек (HEK293T) и человеческого нормальной поджелудочной железы эпителия (ПЭ) клеточной линии ACBRI 515 были приобретены у RIKEN банк клеток и DS Pharma биомедицинских соответственно. Клетки культивируют в RPMI-1640 (BT-20, MDA-MB-231, T47D, LNCaP, OE19 и BXPC3), MEM (MRC5 и A549), DMEM (HEK293T и Caki-1) или CSC (PE), содержащий 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 100 μ г / мл пенициллина и 100 μ г / мл стрептомицина.

Синтеза пептидов
Пептиды, используемые в настоящем исследовании были синтезированы Invitrogen или SIGMA. Все пептиды были синтезированы с использованием твердофазной химии, очищают до однородности (т.е.> 90% чистоты) на обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и оценивается масс-спектрометрии. Пептиды растворяли в воде и буфером до рН 7,4. Последовательность TPR 301K-312K (KAYARIGNSYFK; TPR), TPR мутант 1 (KAYA А. А. GNSYFK; мутировал аминокислоты подчеркнуть), TPR мутант 2 (KAYARIGNS GGG ), и схватка пептид (RKFSAAIGYNKY) были сделаны ячейки проницаемой добавлением спирали III ячейки проникающим последовательность Antennapedia homeodomain (подчеркнуто ниже)[ 29 ], а именно: RQIKIWFQNRRMKWKK KAYARIGNSYFK (Antp-TPR), RQIKIWFQNRRMKWKK KAYAAAGNSYFK (Antp-TPR мутант 1), RQIKIWFQNRRMKWKK KAYARIGNSGGG (Antp-мутант TPR 2), а RQIKIWFQNRRMKWKK RKFSAAIGYNKY (Antp-борьба).

Выражение и очистки домена TPR2A от человека хоп
Домена TPR2A (223K-352L) человеческого хоп был клонирован в рамке в Xho я и Bam HI сайтов ПЭТ-15b для экспрессии в E. кишечной AD494 (DE3) и очищали с использованием никель-хелатирующие смолы колонке, как описано выше[ 30 ]. Для подтверждения наличия очищенный белок, SDS / PAGE была выполнена в соответствии с методом Laemmli[ 31 ].

Поверхностных плазмонов резонанса (SPR)
SPR Эксперименты проводились с 3000 Biacore биосенсор системы, как описано выше [ 30 , 32 ]. Человеческий рекомбинантный хоп, FKBP5, PP5, и очистил TPR2A области хоп белки иммобилизованных на поверхности чипов CM5 датчик через N -гидроксисукцинимида и N -этил- N '- (диметиламинопропил) карбодиимида активации химии в соответствии с инструкциями производителя. Биотин-сопряженных TPR пептид (биотин-TPR) была иммобилизованных на поверхности стрептавидином (SA), датчик чипа. Как аналита, несколько концентрации Hsp90 и Hsp70 вводили над потоком-клеток при скорости потока 30 μ л / мин при 25 ° C. HBS-EP буфера (0,01 М М Hepes/0.15 NaCl/0.005% Твин 20 / 3 мМ ЭДТА, рН 7,4) был использован в качестве буфера работает во время теста для подавления неспецифического связывания. Анализ данных проводили с помощью оценки BIA версии 4.1 программного обеспечения. Конкурс были проведены эксперименты по preincubating Hsp90 и Hsp70 с короткими, определены пептиды или пептидные комбинаторной смесей в соответствии с методом Бринкер и др. .[ 30 ]. Вкратце, белок / пептид смесей были переданы иммобилизованных хоп, FKBP5, PP5 или TPR2A области хоп, и переплетов или Hsp90 Hsp70, чтобы эти белки были соблюдены. SPR сигналов, полученных в отсутствие конкурирующих пептиды были использованы в качестве ссылки (100% обязательную силу), чтобы нормализовать значения, полученные в присутствии пептидов. На конкурс экспериментов определены пептидов концентрация белка TPR оставалось постоянным, тогда как пептид концентрации белка / пептидных смесей была увеличена систематически.

Вестерн-блоттинга
Вестерн-блот анализ проводили, как описано выше [ 33 ]. Короче говоря, белковые экстракты получают из клетки лизировали буфером, содержащим 1% (об. / об), Тритон Х-100, 0,1% (м / о) SDS, и 0,5% (м / о) дезоксихолата натрия, разделенных SDS / PAGE, и переданы на нитроцеллюлозные фильтры. Закаленные мембран были исследованы с антителами и проанализированы с помощью усовершенствованных реагентов хемилюминесценции (GE Healthcare) с LAS-3000 LuminoImage анализатор (Fujifilm).

Анализ на жизнеспособность клеток
Клетки высевали на 96-луночных планшетах в 2000-3000 клеток / лунку и инкубировали с тестом пептида. После инкубации тест для жизнеспособности клеток проводилась с использованием живой клетки графа реагентов SF (Nacalai Tesque) в соответствии с протоколом производителя. Поглощение измеряли при длине волны 450 нм, используя 96-ю лунками читателя (GE Healthcare).

Флуоресцентная микроскопия
BXPC3 клетки помещали в стеклянный дном блюдо на 1 × 10 6 клеток на мл средних и малых аликвоты меченых пептидов, Antp-TPR-TAMRA-OH или TPR-TAMRA-OH (Invitrogen) (15 μ л) были добавлены непосредственно в блюдо в конечной концентрации 10 μ М. Через 2 ч инкубации внутриклеточное проникновение пептидов визуализируется Olympus FV1000 конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (Olympus).

Анализа проточной цитометрии
После инкубации с или без Antp-TPR пептид, клетки собирали и дважды промывают PBS. После этого клетка гранулы ресуспендировали. Проточная цитометрия (Becton Dickinson) анализ проводили с использованием Аннексин V-Fluorescein Окрашивание Kit (Вако) или карбоксифлуоресцеина FLICA каспазы 3 и 7 анализа комплект (иммунохимии технологий) в соответствии с протоколом производителя. Данные были проанализированы с помощью CellQuest программного обеспечения.

Противоопухолевую активность Antp-TPR пептида в опухоли ксенотрансплантаты в естественных условиях
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами Киотской школы медицины университета. Клетки поджелудочной железы клеточная линия BXPC3 (5 × 10 6 клеток), ресуспендировали в 150 μ л PBS, были пересажены подкожно в область фланге 7-9-недельных athymic голым мышам весом 17-21 г. При опухолях составил около 50 мм 3 в объеме, животные были рандомизированы на три группы, и PBS (контроль) или Antp-TPR пептид (1 или 5 мг / кг) вводили внутривенно (50 μ л / инъекции) три раза в неделю в течение в общей сложности девять доз. Опухоли были измерены с суппортом, и объем опухоли (в мм 3 ) была рассчитана по следующей формуле: длина х ширина 2 × 0,5. Все значения выражены как среднее ± SD и статистического анализа была рассчитана путем одностороннего дисперсионного анализа с тест Даннетт. Различия считались значение при Р <0,05.

Иммуногистохимия
Иммуногистохимическое окрашивание проводили, как описано выше [ 34 ]. Короче говоря, BXPC3 опухоли из животных, получавших либо физиологическим раствором или Antp-TPR пептид (5 мг / кг) внутривенно были собраны в конце лечения, а затем заливали в парафин после фиксации с 10% формальдегида в PBS. После deparaffinized и увлажненной, опухоли разделы лечились с антителами, а затем активность пероксидазы был обнаружен путем инкубации в 0,05% 3, 3'-диаминобензидина тетрахлорметана в PBS (pH7.2), содержащий 0,012% H 2 O 2 .

Результаты

Дизайн TPR пептид
Хорошо известно, что функциональная форма Hsp90 является комплекс, в котором шаперонов Hsp90 и Hsp70 собираются вместе, связывая хоп [ 14 ] и сборке этого multiprotein комплекса достигается при помощи двух независимых доменов TPR1 и TPR2A на-хопа. В комплексе TPR2A и С-концевой области Hsp90, Lys Arg 301 и 305 в спирали А3 облигаций TPR2A пожертвовать водорода соответствующих боковыми Asp и Glu в Hsp90 С-концевой области[ 17 ]. Кроме того, Arg 305 в спирали А3 хорошо сохранились среди других областей TPR[ 17 ], и мутации этого остатка Arg в Ала в TPR области Tom70 имеет решающее значение для связывания с Hsp90[ 35 ]. Опираясь на эти данные, мы разработали новый TPR пептид, KAYARIGNSYFK, которая включает в себя значительные и хорошо сохранились и аминокислоты Lys Arg 301 и 305 для привязки к Hsp90, используя структурную информацию, полученную от TPR2A-Hsp90 комплекса (рис.1А ). Как показано на рисунке1 (B) , оба Hsp90 и Hsp70 связывается с иммобилизованным TPR пептида, а также с аналогичными K D значений, 1,42 × 10 -6 (М) и 0,68 × 10 -6 (М) в возрастающих концентрациях лиганда, соответственно, но относительная обязательные способность к Hsp70 TPR пептид для Hsp90 был 49,9% (данные не приведены). Кроме того, K D значение взаимодействия Hsp90 с хоп был также похожие (4,43 × 10 -6 (М), данные не приведены). Оказалось, что пептид TPR не ингибирует взаимодействие Hsp70 с белком хоп по оценке Biacore биосенсор (рис.1С ), и что этот пептид также не влияют на взаимодействие Hsp90 с FKBP5 или PP5 белков (рис.1D ), которые также имеют Hsp90-связывающий домен TPR, как описано выше[ 17 ]. Тем не менее, было показано, что пептид ингибирует TPR взаимодействия Hsp90 с белком хоп (рис.1D ). Назначенного TPR пептида дальнейшей конденсации его N-конца к спирали III белка Antennapedia homeodomain[ 29 ] для получения клеточной проницаемой вариант, гибридные Antp-TPR пептида, как описано в разделе Материалы и методы секции.

Рисунок 1. Конструкция и характеристики TPR пептида . () Прогнозируемая структура предназначена TPR пептида . Разработан TPR пептид получена из спирали А3 области TPR2A и связан C-концевой области Hsp90 показаны с палкой модели с использованием Рас Мол программного обеспечения. Каждое число показывает положение аминокислот в хопа или Hsp90 белков. (B) Sensorgrams из Hsp90 и Hsp70 связан с иммобилизованным TPR пептид, как определяется с помощью биосенсоров Biacore. Все аналитов (0,3, 1 или 2 μ М Hsp90 и Hsp70) вводили в течение пептид TPR. Прогресс связывания с иммобилизованным пептидом TPR контролировали с помощью следующих увеличение сигнала (ответа), индуцированный аналитов. Тонкие и толстые стрелки указывают время начала и окончания инъекции, соответственно. RU указывает резонанс единицы. (C) Конкурс-тест для Hsp70 связывания с пептидными хоп TPR. Hsp70 (1 μ М) был передан иммобилизованных хоп в отсутствии (контроль) или наличие TPR пептида (700 μ М). SPR сигнала при отсутствии конкурирующих пептидов был использован в качестве ссылки (100% обязательную силу). Тонкие и толстые стрелки указывают запуска и остановки инъекции, соответственно. Равновесие ответ уровней, полученные в присутствии конкурирующих пептиды - TPR пептида была нормализована и заговор против пептида концентрации, как описано в Материалы и методы секции (вставка график). (D) Конкурс Hsp90 привязки к хоп, FKBP5 или PP5 с TPR пептида. Hsp90 (1 μ М) был передан иммобилизованных хоп, FKBP5 или PP5 в наличии или отсутствии повышения концентрации TPR пептид (14, 140 или 700 μ М). SPR сигнала при отсутствии конкурирующих пептидов был использован в качестве ссылки (100% Hsp90 обязательными).
Избирательность гибридных Antp-TPR и значение высоко консервативных аминокислот в пептид TPR для противоопухолевой активности
На основе анализа взаимодействия разработан гибридный Antp-TPR пептид с Hsp90 человека белок, мы тогда рассмотрели рак жизнеспособности клеток для оценки селективности этого пептида в различия между нормальными и раковыми клетками. Как показано на рисунке2 () , Antp-TPR пептид вызвано зависит от концентрации потеря человеческого жизнеспособности клеток рака (в линиях Caki-1, BXPC3, T47D, и A549 клетки), однако, одинаковые концентрации этого пептида не очевидно уменьшить жизнеспособность нормальных человеческих клеточных линий (HEK293T, MRC5 и PE) (рис.2А ) и TPR пептид без Antp, клетка-проницаемой пептид, не влияет на нормальное или раковые клетки (рис.2B ). Конфокальной микроскопии анализа также показали, что Antp-TPR пептид помечены TAMRA проникли раковые клетки, в то время как TPR-TAMRA пептид без последовательности Antp не проникал к раковым клеткам (Дополнительный файл1 ). Кроме того, борьба Antp-пептид не влиял на эти клеточные линии (данные не приведены). Для линий раковых клеток тестирование, Antp-TPR пептид показал IC 50 значений от 20 до 60 μ М. С другой стороны, TPR пептид не показали цитотоксичность по отношению к либо эти раковые клетки линии или нормальные клетки (табл.1 ). Эти результаты показывают, что пептид TPR в сочетании с Antp, клетка-проницаемой пептид обладает селективной противоопухолевой активности, что различие между нормальной и опухолевой клетки. Кроме того, как показано на рисунке2 (C) и2 (D) , Antp-TPR мутант 1 и 2 пептидов не показал выборочный деятельности противоопухолевым, когда эти пептиды были протестированы как с нормальных и раковых клеточных линий. Это говорит о том, что мутировавший аминокислот в Antp-TPR мутанты 1 и 2 являются необходимым условием для селективной противоопухолевой активностью из-Antp TPR.

Таблица 1. ингибирующая концентрация (IC 50 ) из Antp-TPR
Дополнительный файл 1. Внутриклеточные проникновения antennapedia спирали III homeodomain (Antp)-сопряженных Antp-TPR гибридных пептида . BXPC3 клетки инкубировали с 10 μ М carboxytetramethyl родамин (TAMRA) меченных Antp-TPR (Antp-TPR-TAMRA) или TPR (TPR-TAMRA), как указано. Клетки затем анализировали фазового контраста (DIC), флуоресценции (TAMRA-красный) или объединить изображения (ДВС-синдром и TAMRA-красный). Все снимки были сделаны с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, как описано в методы. Все масштабе баров 50 μ м.
Формат: TIFF Размер: 758Kb Скачать файл
Рисунок 2. Разработан гибридный Antp-пептида TPR демонстрирует избирательность для раковых клеток убийства . (А) указано рака или нормальные клеточные линии инкубируют с Antp-TPR пептида. (B) TPR пептид необходимо сочетать с Antp, клетка-проникающей пептид, к выборочному уничтожать клетки эффект. (C, D) Мутация анализ TPR пептид изучения его влияния на гибели клеток. Указанных линий клеток инкубировали с Antp-TPR мутант 1 (C), в котором хорошо сохранились и Arg и последующие аминокислоты, Иль, в пептид TPR были заменены на Ala, или мутант 2 пептида (D), в которой за последние три аминокислот TPR, Tyr-Phe-Lys, были заменены на три Gly остатков сорвать спираль структуры TPR. Все жизнеспособность клеток анализировали через 72 ч инкубации тест пептиды, как описано Материалы и методы секции. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение от эксперименты, проведенные в трех экземплярах.
Конкурс TPR2A-опосредованного взаимодействия белка разработана TPR пептид
Кроме того, мы исследовали, является ли разработаны TPR пептид был в состоянии конкурировать специально для взаимодействия Hsp90 с доменом TPR2A из-хоп, которая необходима для правильного складывания несколько онкогенных белков в раковых клетках [ 18 - 20 ]. Hsp90 был передан сенсорный чип проведения иммобилизованных очищенного рекомбинантного домена TPR2A от человека хоп либо в отсутствии или присутствии увеличивающихся концентраций TPR пептид (рис.3 ). Сигнал SPR в отсутствие пептида конкурентом был использован в качестве ссылки (100% обязательную силу) для нормализации сигналов для Hsp90 обязательным записан в присутствии пептида. Взаимодействие домена TPR2A хмеля с Hsp90 был боролись за по TPR пептид (рис.3А и3C ). В отличие от пептида TPR борьба и TPR мутант пептиды 1 и 2 не продемонстрировали какого-либо взаимодействия белка при анализе со скоростью до миллимолярных концентрации (рис.3B и3C ). Эти результаты показывают, что разработан TPR пептид конкретного конкурента, способные ингибировать взаимодействие между Hsp90 и домен TPR2A из-хоп, и что аминокислоты целевых мутагенеза в нашем эксперименте имеют решающее значение для взаимодействия этого белка, чтобы произойти.

Рисунок 3. Конкурс Hsp90 привязки к домена TPR2A хмеля . Hsp90 (1 μ М) был передан иммобилизованных TPR2A область человеческого хоп (5000 единиц резонанс [RU]), в отсутствие или присутствие на повышение концентрации TPR () или TPR схватка (B) пептид (1,4, 14, 140, 280, и 700 μ М и 1 мм). SPR сигнала при отсутствии конкурирующих пептидов был использован в качестве ссылки (100% обязательную силу). (C) Равновесие ответ уровней, полученные в присутствии конкурирующих пептиды - TPR (KAYARIGNSYFK), TPR схватка (RKFSAAIGYNKY), TPR мутант 1 (KAYAAAGNSYFK), или TPR мутант 2 (KAYARIGNSGGG) - были нормализованы и заговор против пептида концентрации, как описано в Материалы и методы секции.
Характеристика, убивающих рак клеток и потере клиента белков Antp-TPR пептид
Как упоминалось ранее, взаимодействие Hsp90 с хопа в раковых клетках имеет большое значение для складывания несколько белков, в том числе сурвивина онкоген, который является членом ингибитор апоптоза семья ген [ 27 ]. Кроме того, Antp-TPR имеет селективное цитотоксическое активность в отношении раковых клеток и является ингибитором взаимодействия Hsp90 с доменом TPR2A хмеля (рис.2 и3 ). Эти результаты побудили нас исследовать вопрос о том Antp-TPR вызывает апоптоз в раковых клетках. Как оценивается анализ потока цитометрии, аннексина В или каспазы 3 и 7 положительных клеток было обнаружено, когда Antp-TPR пептид был добавлен к раку молочной железы T47D клетки (рис.4А , средней и правой панелей переулок), предполагая, что этот пептид вызывает гибель раковых клеток за счет механизм апоптоза (рис.4А , средней и правой панелей переулок). С другой стороны, не было появление аннексина V-меченых HEK293T клеток после добавления этого гибрида пептид (рис.4А , левая панель переулок). В совокупности с фигурами2 и3 , было показано, что Antp-TPR пептид разработан в этом исследовании, при условии, селективность к раковым клеткам, различия между нормальными и раковыми клетками.

Рисунок 4. Характеристика, убивающих рак клеток и потере клиента гибридных белков Antp-TPR пептида . (А) HEK293T и T47D клетки, обработанные (+) или без (-) Antp-TPR пептид (68 μ М) были проанализированы после 24 часов по двухцветными проточной цитометрии для аннексина V (левой и средней полосы панелей) или каспазы 3 и 7 (правой панели переулок) маркировки в зеленом канале, и пропидий йодида (PI) окрашивание в красный канал, как описано в Материалы и методы секции. Процент клеток в каждом квадранте указана, а эксперименты проводились в два раза с аналогичными результатами. (В) Потеря белков Hsp90 клиента. T47D клетки инкубировали с Antp-TPR пептид (68 μ М) в течение 48 ч и проанализированы западных промокательной с указанными антителами. (C) Вестерн-блот анализ Hsp90, Hsp70, и сурвивина выражение в нормальных и опухолевых клеточных линий HEK293T, Caki-1, BXPC3, T47D, и A549. Сотовые выдержки из этих клеточных линий были исследованы на экспрессию белка на Вестерн-блот анализ. β -актин был использован в качестве управления загрузкой.
Когда мы исследовали уровни белков Hsp90 клиента после внутриклеточного загрузки Antp-TPR пептид, T47D клетках, обработанных Antp-TPR выставлены потеря нескольких белков Hsp90 клиента, в том числе сурвивина, CDK4, и Акт, по оценке западных промокательной (рис. 4B ). В противоположность этому, Antp-TPR пептида не влияют уровня Hsp90 себя (рис.4B ). При нормальных и опухолевых клеточных линий (HEK293T, Caki-1, BXPC3, T47D, и A549) получил тепловой шок, до-регулирование Hsp90 и Hsp70 наблюдается в раковых клетках, но не в нормальных клетках HEK293T (Дополнительный файл2 ). Кроме того, до-регулирование Hsp70 после лечения с помощью этого пептида не наблюдалось в обеих рака и нормальных клеточных линиях (Дополнительный файл2 ). Когда мы исследовали уровни экспрессии Hsp90, Hsp70, и сурвивина в этих клеточных линий с использованием западных промокательной, было обнаружено, что экспрессия Hsp90 были почти равны между нормальными и раковыми клетками, однако, был очень сурвивина выражается в линиях раковой клетки, и уровень экспрессии Hsp70 отличался среди этих клеточных линий (рис.4С ). Эти результаты показывают, что Antp-TPR пептид разработан в данном исследовании, может повлиять клеточного выживания пути в раковых клетках, конкурируя с cochaperone найма, которая необходима для правильного сворачивания белков Hsp90 клиента.

Дополнительный файл 2. Влияние теплового шока или Antp-TPR пептид лечения на уровни экспрессии Hsp90 и Hsp70 белка в нормальных и раковых клеток . (А) Вестерн-блот анализа в нормальных и опухолевых клеточных линий (HEK293T, Caki-1, BXPC3, T47D, и A549), получающих теплового шока. Клеточные экстракты через 2 часа термической обработки шок (43 ° С) исследовались на экспрессию Hsp90 и Hsp70 на Вестерн-блот анализа с использованием специфических антител. (B) уровни экспрессии Hsp70 в нормальных и опухолевых клеточных линий (HEK293T, Caki-1, BXPC3, T47D, и A549) рассматриваются с гибридными Antp-TPR пептида. Клеточные экстракты после лечения Antp-TPR пептида были исследованы на экспрессию Hsp70 на Вестерн-блот анализа с использованием специфических антител. β -актин был использован в качестве управления загрузкой.
Формат: TIFF Размер: 175Kb Скачать файл
Противоопухолевую активность Antp-TPR пептида в естественных условиях
Для оценки противоопухолевого действия Antp-TPR пептида в ксенотрансплантата модели человеческого рака, BXPC3 клетки рака поджелудочной железы были имплантированы подкожно в athymic голым мышам и животных лечили Antp-TPR пептида. Контрольная группа выставлены прогрессивного роста опухоли, достигнув 749 мм 3 в день 58 (рис5А ). С другой стороны, администрация Antp-TPR пептид (1 или 5 мг / кг, вводят внутривенно три раза в неделю в течение 3 недель) подавляется рост опухоли замечательно. В день 58, средний объем опухоли был 371 мм 3 в 1 мг / кг доза группы и 204 мм 3 в 5 мг / кг доза группе ( P <0,05 по сравнению с контрольной группой) (рис.5А ). Иммуногистохимическое окрашивание также показали, что Antp-TPR пептид привело к потере клиентов Hsp90 белка (CDK4) в BXPC3 опухолей в естественных условиях после лечения, хотя опухоли от солевых группа выставлена ​​обширная маркировки этого белка (рис.5B ). Кроме того, гистологического исследования печени, почек и легких в равной степени ничем не примечательный в физиологическом растворе или гибридных пептид-мышей (рис.5C ). Эти результаты позволяют предположить, что новый дизайн гибридных Antp-TPR пептид успешно вызывает опухоль смерти через потерю белков Hsp90 клиента в естественных условиях .

Рисунок 5. противоопухолевую активность гибридных Antp-TPR пептида в естественных условиях . (А) BXPC3 клетки рака поджелудочной железы были имплантированы подкожно в athymic голым мышам. Внутривенная инъекция либо PBS (контроль) или Antp-TPR пептид (1 или 5 мг / кг) была предоставлена ​​из 4-й день, как указано стрелками. В каждой группе было шесть животных (п = 6), а опыты были повторены дважды. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение. (B) Утрата Hsp90 клиента белка (CDK4) в опухолях получавших Antp-TPR пептида в естественных условиях . BXPC3 опухоли из физиологического раствора или Antp-TPR пептид (5 мг / кг) у подопытных животных были собраны в конце лечения и проанализированы с помощью антител к CDK4 по иммуногистохимии. Шкала баров, 25 μ м. (C) При гистологическом исследовании после лечения Antp-TPR пептид гибрид. Изображения (x400 увеличении) печени, почек и легких у мышей после лечения с помощью физиологического раствора (контроль), или Antp-TPR пептид (5 мг / кг), в девяти случаях были получены путем окрашивания гематоксилином и эозином (H & E).
Обсуждение

В этом исследовании мы разработали, определены, и характеризуется TPR пептид, роман противоопухолевые пептидомиметик по образцу обязательным интерфейс между Hsp90 и домен TPR2A хмеля. Как показано в недавней структуры подход, TPR2A различие между С-концевой пять остатков Hsp90 (MEEVD) и С-концевой последовательности Hsp70 (PTIEEVD) со своим основным шесть спиралей (A1, B1, A2, B2, A3 и B3)[ 17 , 30 ]. В этих спиралей, Lys Arg 301 и 305 из спирали А3 особенно важно для их взаимодействия водородных связей с боковых цепей Asp и Glu остатков Hsp90 С-концевой пептид[ 17 ]. Эта информация побудило нас разработать пептид использованием домена TPR2A хмеля, в том числе хорошо сохранились остатки Arg 305 спирали А3, которые могли бы конкурировать по взаимодействию с Hsp90, а для тестирования цитотоксичности этого пептида в пробирке и его противоопухолевой активности в естественных условиях . Интересно, что оба Hsp90 и Hsp70 были способны связывать разработан TPR пептид (рис.1В ), однако, относительная обязательным способность Hsp70 на этот пептид был ниже, чем у Hsp90, и этот пептид не смогли препятствовать взаимодействию с Hsp70 хоп белка (рис.1С ), а также взаимодействие Hsp90 с FKBP5 или PP5 (рис.1D ). Кроме того, TPR пептид ингибирует взаимодействие Hsp90 с хопа в частности. Эти результаты показывают, что разработан пептида в этом исследовании является специфическим ингибитором взаимодействия Hsp90 с хоп белка. Как показано на рисунке (2А и2B ) и дополнительный файл1 , предназначен гибридных Antp-TPR пептид, со своей клеточной проницаемой последовательностях, полученные homeodomain Antennapedia, продемонстрировал селективной противоопухолевой активностью, различия между нормальными и раковыми клетками. Было также показано, что мутации TPR пептид заменяя хорошо сохранились остатки Arg и последующего Иль в TPR2A спирали А3 с двойным Ала (мутант 1) приводившая к потерять и его способность подавлять Hsp90-TPR2A взаимодействия и его противоопухолевой активности ( данные2B, C , и3 ). Другая мутация TPR пептида, в котором Tyr-Phe-Lys был заменен с тройным Gly сорвать спиральную структуру (мутант 2), как оказалось, эффект похож на мутанта 1, предполагая, что эти аминокислоты являются критическими для ингибирования и противоопухолевая активность.

Интересно, что Antp-TPR пептида раковых клеток конкретного в его цитотоксическую активность и менее цитотоксическое действие на нормальные клетки, в том числе HEK293T, ПЭ, и MRC5 (рис. 2А ), хотя уровни экспрессии Hsp90 не очень сильно отличаются между нормальными и раковыми клетками (рис.4С ). В противоположность этому, сурвивина была выражена высокая в раковых клетках (рис.4C ), а чувствительность этих линий раковых клеток к Antp-TPR коррелирует с выражением этого белка (рис.2А ). Хорошо известно, что антиапоптотического белки, такие как сурвивина более выражено в раковых клетках, играть значительную роль в подавлении апоптоза или гибель клеток, и нокдаун этих белков в раковых клетках внимания к апоптозу[ 27 , 28 ]. Поскольку раковые клетки, обработанные этот гибрид пептида аннексина V и 3 каспазы, 7 положительных по оценке методом проточной цитометрии, и этот пептид также вызвало потерю белков Hsp90 клиентов, включая сурвивина (рис.4 ), мы предлагаем механизм действия Antp-TPR пептида раковыми клетками убийства следующим образом. Во-первых, Antp-TPR пептид ингибирует Hsp90-Hop взаимодействия, и это влияет на торможение правильного складывания этих белков Hsp90 клиента, включая анти-апоптотических белков, таких как сурвивина, и этот эффект может иметь решающее значение особенно в раковых клетках вызывают гибель клеток путем апоптоза механизм. Кроме того, было также обнаружено, что Antp-TPR пептид не вызывало до-регулирование Hsp70 после лечения с помощью этого пептида (дополнительный файл2 ). Поэтому предполагается, что этот пептид может дать дополнительные преимущества по сравнению с Hsp90 ориентированных небольшие соединения, так как обычные Hsp90 ингибиторы АТФазы вызывает компенсационных до регуляции Hsp70, которые, вероятно, коррелирует с уменьшением противораковой активностью, как сообщалось ранее[ 36 , 37 ]. Было также продемонстрировано, что Antp-TPR пептид оказали значительное противоопухолевую активность у мышей xenografted с человеческим раком поджелудочной железы (BXPC3) приведет к потере CDK4, который является одним из Hsp90 клиента белков в опухоли. (Рис.5А и5B ), предполагая, что этот гибрид пептид администрируемых внутривенно проникает опухолевых клеток, ингибирует взаимодействие Hsp90 с хоп взаимодействия, приводит к потере белков Hsp90 клиента, и индуцирует противоопухолевую активность в естественных условиях с аналогичным механизмом показано на анализ в лабораторных условиях. Более того, гистологического исследования предположили, что управляется Antp-TPR пептид не нанесло серьезный ущерб главных органов (печень, почки и легкие) и нормальных тканей, и любое аномальное поведение или потеря аппетита после лечения с помощью этого пептида не было и наблюдается. Эти результаты позволяют предположить, что этот пептид может не вызывать серьезных побочных эффектов после лечения. Взятые вместе, эти особенности предназначены Antp-TPR пептид будет предлагать привлекательные новых противораковых терапевтический выбор для молекулярных целевой терапии рака.

Ранее мы сообщали, противоопухолевая активность иммунотоксинов, включая таргетинг составляющей, такой как лиганд или антитела для обеспечения избирательности раковой клетки, и убийство фрагмент, таких как белок токсина [ 38 - 40 ]. Эти обычные иммунотоксины обычно присутствуют препятствия во время клинического применения, таких как иммуногенность, нежелательно токсичности, трудности в производстве, ограниченный период полураспада, и производство нейтрализующих антител[ 41 - 43 ]. Тем не менее, химический синтез позволяет нам производить пептидов по доступной цене, со стоимостью сравнимой с производства белковых препаратов. Более того, из-за легкого производство пептидов, широкий выбор кандидата пептидов объединения фрагментов для ориентации и токсичность может быть проверена в доклинических настройки.

В последнее время Gyurkocza и др. . сообщил Роман пептидил антагонистом взаимодействия между Hsp90 и сурвивина и показали, что этот пептид причины массовой гибели раковых клеток, но не уменьшает жизнеспособность нормальных клеток[ 25 , 26 ]. Кроме того, он также сообщил, что разработаны новые модули TPR, который связывается с С-конца Hsp90 с высоким сродством, снижение уровня HER2 BT474 HER2-позитивных клеток рака молочной железы, что приводит к гибели этих клеток[ 44 ]. В совокупности с нашим текущим исследования, эти результаты показывают, что пептиды, направленных на Hsp90 может быть мощным и новых селективных противоопухолевых препаратов.

Заключение

Новой конструкции гибридного Antp-TPR пептид, описанных в данном исследовании молекулярного особенности ингибитор Hsp90-Hop взаимодействия, которое имеет решающее значение для складывания несколько белков клиента в раковых клетках. Более того, анализ этого пептида в естественных условиях показало, что он отображает значительное опухоли подавления активности у мышей с человеческой опухоли поджелудочной железы. В силу этих особенностей, Antp-TPR пептид может обеспечить мощный и селективный новой терапии рака, в соответствии с использованием пептидомиметиков в целевых терапии рака[ 45 ]. Результаты этого исследования помогут в дальнейшем разъяснении лечения рака таргетинга Hsp90.

Сокращения

Hsp90: белка теплового шока 90; хопа: p60/Hsp-organizing белка; TPR: tetratricopeptide повторить; Antp: antennapedia homeodomain последовательности; IC50: пептид концентрации вызывающих 50% ингибирование контролировать рост клеток; PI: пропидий йодида; SPR: поверхностных плазмонов резонанса; RU: резонанс единицы; SDS: додецилсульфата натрия.

Конфликт интересов

Кодзи Каваками является основателем и владельцем акции добывающих бесконечность, Inc другие авторы раскрывают никаких потенциальных конфликтов интересов.

Авторы взносов

TH, М. К., К. К. разработали эту исследовательскую работу. TH предназначен Antp-TPR пептида, и осуществляется связывание, торможение анализа по SPR техники и анализа жизнеспособности клеток в пробирке. KO осуществляется механизм смерти раковых клеток FACS анализ в лабораторных условиях. MH и КО проводится в естественных условиях анализа по модели ксенотрансплантата мыши, KO осуществляется иммуноцитохимии анализ с использованием опухолевых раздел после того как в естественных условиях анализа. TH, М. К., К. К., интерпретировать данные и написал рукопись. Все авторы читали и одобрили окончательный рукописи.

Благодарности

Мы благодарим доктора Toshiya Hayano (Департамент биологических наук и технологий, факультет естественных наук и техники, Ritsumeikan университет) за советы по использованию системы Biacore. Мы также благодарим Рицуко Асаи, Мегуми Кавамото, Нана Кавагути и Куми Кодама (Департамент фармакоэпидемиологии, Киотский университет) за техническую помощь в культуре ткани. Это исследование было организовано грант Olympus Ко

Ссылки

Хартл ФУ, Хайер-Хартл М: молекулярных шаперонов в цитозоле: от зарождающейся цепи сложенном белка.
Наука 2002, 295 : . 1852-1858 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Перл ЛГ, Продрому C: Структурные и в естественных условиях функции Hsp90.
Curr ОПИН структуры Biol 2000, 10 : 46-51. Издательство Полный текст
Молодые JC, Moarefi I, Хартл FU: Hsp90: специализированные, но необходимых белков складной инструмент.
J Сотовые Biol 2001, 154 : 267-273. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | PubMed Central Полный текст
Сикорский RS, Boguski MS, Goebl М, Hieter P: повторяющийся мотив аминокислоты кислоты в CDC23 определяет семейство белков и новые отношения между генов, необходимых для митоза и синтез РНК.
Сотовые 1990, 60 : 307-317. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Хирано Т, Киносита N, Морикава К Yanagida М: Привязка спирали с ручкой и отверстием: основные повторяется в С. ротЬе ядерный белок nuc2 +.
Сотовые 1990, 60 : 319-328. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Goebl М, Yanagida М: спираль TPR оснастки: роман мотив повторять белка из митоза в транскрипции.
Тенденции Biochem Научно 1991, 16 : . 173-7 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Lamb JR, Tugendreich S, Hieter P: Tetratrico пептид повторить взаимодействия: в TPR или не TPR?
Тенденции Biochem Научно 1995, 20 : . 257-259 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Blatch GL, Lässle М: tetratricopeptide повторяю: структурный мотив посредническую белок-белковых взаимодействий.
BioEssays 1999, 21 : . 932-939 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Ирмер H, Höhfeld J: Характеристика функциональных областей эукариотических совместно шаперон-хопа.
J Biol Chem 1997, 272 : . 2230-2235 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Продрому C, Panaretou B, Чохан S, Siligardi G, R О'Брайен, Ladbury JE, икра SM, Пайпер PW, Перл Льюис Хэмилтон: цикл АТФ-азы из Hsp90 диски молекулярных "зажим" через переходные димеризации N-концевые домены.
EMBO J 2000, 19 : 4383-4392. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | PubMed Central Полный текст
Молодые JC, Obermann WM, Хартл FU: Специфическое связывание белков tetratricopeptide повторять С-концевой 12-кДа области Hsp90.
J Biol Chem 1998, 273 : . 18007-18010 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Рэмси AJ, Рассел LC, Уитт SR, Chinkers М: Перекрытие участков tetratricopeptide связывающий белок повторить и сопровождающих деятельность белка теплового шока 90.
J Biol Chem 2000, 275 : . 17857-17862 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Chen S, Смит Д. Ф.: хоп как адаптер белка теплового шока 70 (Hsp70) и Hsp90 шаперона техники.
J Biol Chem 1998, 273 : . 35194-35200 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Джонсон BD, Шумахер RJ, Росс Д., Тофт DO: хоп модулирует Hsp70/Hsp90 взаимодействий в сворачивания белка.
J Biol Chem 1998, 273 : . 3679-3686 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Моришима Y, Kanelakis KC, Silverstein А.М., Дитмар К., Эстрада L, Pratt ВБ: белка Hsp организатор хоп увеличивает скорость, но не является необходимым для глюкокортикоидных складной рецептора multiprotein Hsp90 основе шаперона системы.
J Biol Chem 2000, 275 : . 6894-6900 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Бозе S, Weikl T, H Bugl, Бюхнера J: сопровождающий функции Hsp90-ассоциированных белков.
Наука 1996, 274 : . 1715-1717 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Scheufler C, Бринкер, Bourenkov G, Пегораро S, L Moroder, Bartunik H, Хартл ФУ, Moarefi I: Структура TPR домен-пептидных комплексов: Критические элементы в сборке-Hsp70 Hsp90 multichaperone машины.
Сотовые 2000, 101 : 199-210. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Скотт доктор медицинских наук, Фридман J: Aberrant складывания белка молекулярной основы рака.
Методы Молекулярная биология 2003, 232 : . 67-76 PubMed Аннотация
Neckers L, Mimnaugh Е, Шульте ТВ: Hsp90 как противораковые цели.
Наркотиками Resist Обновления 1999, 2 : . 165-172 Издатель Полный текст
Рабочий P, F Берроуз, Neckers L, Rosend N: давать наркотики рак шаперона Hsp90: Комбинационные терапевтического использования наркомании онкогенов и опухолевых стресса.
Энн Нью-Йорк Изд-во АН 2007, 1113 : . 202-216 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Айзекс JS, Сюй Вт, Neckers L: Белок теплового шока 90 в качестве молекулярной мишени для рака терапии.
Рак Сотовые 2003, 3 : 213-217. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Sausville Е.А., Томашевского JE, Плющ P: Клиническая развития 17-demethoxygeldanamycin.
Curr Рак лекарственных мишеней 2003, 3 : . 377-383 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Neckers L, Плющ SP: Белок теплового шока 90.
Curr ОПИН Oncol 2003, 15 : . 419-424 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Бассо н.э., Solit DB, Мюнстер П.Н., Rosen N: Ansamycin антибиотики подавляют активацию Akt и циклин D выражение в груди раковые клетки, которые гиперэкспрессией HER2.
Oncogene 2002, 21 : 1159-1166. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Plescia J, Salz W, F Ся, Pennati М, N ЗАФФАРОНИ, Daidone М.Г., Мели М, Dohi T, P Fortugno, Нефедова Y, Д. И. Габриловича, Коломбо G, Альтьери DC: Рациональный дизайн shepherdin, роман противоопухолевых агентов.
Рак Сотовые 2005, 7 : 457-468. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Gyurkocza B, Plescia J, Raskett CM, Гарлик DS, Лоури П. А., Картер Б.З., Andreeff М, М Мели, Коломбо G, Альтьери DC: антилейкемической деятельности shepherdin и молекулярной разнообразие Hsp90 ингибиторов.
J Natl Рак Inst 2006, 98 : . 1068-1077 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Салвесен GS, Дакетт CS: Апоптоз: ИПФ белков: блокирование дороги к смерти.
Nat Rev Мол сотовый Biol 2002, 3 : 401-410. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Альтьери DC: Пользователи выживших, как рак терапевтической мишенью.
Nat Rev Рак 2003, 3 : . 46-54 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Kabouridis PS: Биологические применении белковых технологий трансдукции.
Тенденции Biotechnol 2003, 21 : 498-503. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | PubMed Central Полный текст
Бринкер, Scheufler C, Von Der Mulbe F, Флекенштайн B, C Херрманн, Юнг G, Moarefi I, Хартл FU: Лиганд дискриминации по доменам TPR. Актуальность и селективность EEVD-признание в HSP70 - хоп - Hsp90 комплексов.
J Biol Chem 2002, 277 : . 19265-19275 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Laemmli Великобритании: Расщепление структурных белков при сборке головы бактериофага Т4.
Природа 1970, 27 : . 680-685 Издатель Полный текст
Horibe T, H Нагаи, Сакакибара К Хагивара Y, Кикучи М: Ribostamycin ингибирует активность шаперона белка изомеразы дисульфида.
Biochem Biophys Res Commun 2001, 289 : . 967-972 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Чжао Q, Ван J, Levichkin IV, Стасинопулос S, Райан MT, Hoogenraad Нью-Джерси: митохондриальной конкретной реакции на стресс в клетках млекопитающих.
EMBO J 2002, 21 : 4411-4419. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | PubMed Central Полный текст
Шин М, Н Nakamuta, Ода-Уэда N, Ларссон Л.И., Фудзивара K: Иммуноцитохимическая демонстрация полиаминов в ядрышек и ядер.
Histochem сотовый Biol 2008, 129 : 659-665. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Молодые JC, Hoogenraad Нью-Джерси, Хартл FU: Молекулярная шаперонов Hsp90 и Hsp70 доставить preproteins для митохондриальных рецепторов импорт Tom70.
Сотовые 2003, 112 : 41-50. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Чжан H, D Чун Ян YC, Нили L, S Tsurumoto, Вентилятор J, Чжан L, M Biamonte, Brekken J, K Лундгрен, Берроуз F: выявление новых биомаркеров для клинических испытаний ингибиторов Hsp90.
Мол рака Там 2006, 5 : 1256-1264. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Песня D, R Chaerkady, Тан переменного тока, Гарсиа-Гарсиа Е, Nalli, Суарес-Готье, Лопес-Риос F, Чжан XF, Соломон, Тонг J, чтение М, Фриц С, и др. :. противоопухолевую активность и молекулярных эффект ударной роман тепла белка 90 ингибитор, IPI-504, при раке поджелудочной железы.
Мол рака Там 2008, 7 : 3275-3284. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Каваками K, M Каваками, Хусейн SR, Пури РК: Ориентация интерлейкина-4 рецепторы для эффективной терапии рака поджелудочной железы.
Cancer Res 2002, 62 : . 3575-3580 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Каваками K, M Каваками, Пури РК: В частности преднамеренного убийства интерлейкина-13 (IL-13), экспрессирующих рецепторы рака молочной железы на Ил-13 слияние цитотоксин в животных моделях болезни человека.
Мол рака Там 2004, 3 : 137-147. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Каваками К Terabe М, Kioi М, Berzofsky JA, Пури РК: внутриопухолевые терапии IL13-PE38 приводит к эффективной CTL-опосредованного suprresion из IL13R альфа2-выражения контралатеральной опухоли.
Clin Cancer Res 2006, 12 : . 4678-4686 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Kreitman RJ: Иммунотоксины для таргетной терапии рака.
AAPS J 2006, 8 : E532-551. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | PubMed Central Полный текст
Ли Z, Ю. Т, Чжао Р, Ма J: Иммунотоксины и терапии рака.
Сотовые Мол Immunol 2005, 2 : . 106-112 PubMed Аннотация
Поузи JA, Khazaeli Мб, Bookman М.А., Nowrouzi, Гризл МЫ, Торнтон J, Кэри DE, Лоренц М., Sing А.П., Siegall ЦБ, LoBuglio А.Ф., Салех МН: Я фазе испытания одноцепочечных иммунотоксином SGN-10 ( BR96 SFV-PE40) у пациентов с солидными опухолями.
Clin Cancer Res 2002, 8 : . 3092-3099 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Cortajarena А.Л., Yi F, Риган L: Разработанный TPR модулей, как новые противораковые агенты.
ACS химической биологии 2008, 3 : . 161-166 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
Гиллемард V, Saragovi HU: Новые подходы для таргетной терапии рака.
Curr Рак наркотиками Цели 2004 года, 4 : . 313-326 PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
http://www.translational-medicine.com/content/9/1/8