Японским ученым впервые в мире удалось получить снимок лекарства, проникающего в раковую опухоль мозга
31 . 01 . 2009 | 12 : 40
Версия для печати
ТОКИО, 31 января. /Корр. ИТАР-ТАСС Алексей Сухоруков/. Группе японских ученых впервые в мире удалось получить снимки, которые позволяют наглядно отследить процесс распространения лекарственного препарата внутри раковой опухоли головного мозга. Это достижение может открыть новые возможности для онкологии, в частности, позволит точнее определять необходимую каждому конкретному пациенту дозу лекарства, сообщают сегодня токийские газеты.
Успех изысканий обеспечил препарат, получивший по- японски название "Сурэню" /SLENU/. Японские исследователи из соседней с Токио префектуры Тиба получили его, смешав медикамент от рака и "контрастное вещество" - краситель. Уже через 20 секунд после того, как это лекарство ввели подопытной мыши, с помощью магнитно-резонансной томографии /МРТ/ ученые получили снимок, на котором были отчетливо видны участки, куда проник препарат.
Японская пресса отмечает, что новый метод позволяет также реально оценивать эффективность лечения, поскольку "Сурэню" дает возможность фиксировать погибшие клетки.
Отчет о работе японских медиков в скором времени будет опубликован в одном из американских научных журналов.
www.ami-tass.ru
Saturday, January 31, 2009
Thursday, January 29, 2009
Введите текст или·URL веб-страницы. Перевод: английский » русский
Group B streptococcal conjugate vaccines
C J Baker, M S Edwards
Section of Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas 77030, USA
Correspondence to:
Correspondence to:
Dr M S Edwards, Baylor College of Medicine, One Baylor Plaza, Room 302A, Houston, Texas 77030, USA;
morvene@bcm.tmc.edu
Accepted for publication 5 October 2002
ABSTRACT
Linkage of bacterial capsular polysaccharides to proteins to create conjugate vaccines has had a dramatic impact on the health of children. Although unconjugated polysaccharides are poorly immunogenic in infants and some older children and adults, their covalent coupling with proteins stimulates T cell dependent antigenic recognition that profoundly enhances immunogenicity. In the decade since the introduction and widespread use of Haemophilus influenzae type b polysaccharide conjugate vaccines in the United States, invasive H influenzae infections have become a rarity in childhood.1 Similarly, the conjugation of polysaccharides of Streptococcus pneumoniae to a derivative of diphtheria toxoid and the addition of pneumococcal conjugate vaccine to infant immunisation schedules carries with it promise for a similar decline in the incidence of invasive pneumococcal disease in paediatric patients.2
--------------------------------------------------------------------------------
Keywords: vaccine; streptococcus
Abbreviations: CPS, capsular polysaccharide; GBS, group B streptococcus; GMC, geometric mean concentration; IAP, intrapartum antibiotic prophylaxis; TT, tetanus toxoid
Invasive disease caused by group B streptococcus (GBS) remains a major cause of mortality and morbidity in neonates and young infants. Despite the introduction and widespread implementation of maternal intrapartum antibiotic prophylaxis (IAP) in the USA since 1996, an estimated 2200 neonates during the first week of life and 1400 infants 7–89 days of age will develop invasive GBS disease annually; 140 of these cases will be fatal.3 While maternal IAP is unquestionably effective and has reduced the incidence of early onset disease by nearly 75%, it is at best an interim intervention that does not prevent all early onset and has no influence on the incidence of late onset GBS disease. For example, since 20–25% of delivering women in the USA currently are receiving IAP, the development of penicillin resistance among GBS isolates is a concern that theoretically could render this intervention ineffective. Already a recent and substantial increase in resistance to erythromycin and clindamycin among GBS has been documented by several groups of investigators.4–6
The intent of this review is to provide an update on the status of GBS polysaccharide–protein conjugate vaccines. The review will present the rationale for the development of GBS conjugate vaccines, the current status of clinical trials with these vaccines, and prospects for the future use of GBS conjugate vaccines.
THE RATIONALE FOR GBS POLYSACCHARIDE–PROTEIN CONJUGATE VACCINES
A protective role for antibodies to the capsular polysaccharide (CPS) of type III GBS was predicted in the 1970s by Baker and Kasper.7 These investigators showed that infants with invasive early or late onset GBS disease were born to mothers with very low levels of III CPS specific antibodies in sera at delivery. The finding that human sera containing a sufficient concentration of CPS specific IgG promoted efficient opsonisation and phagocytosis in vitro and provided protection from lethal experimental infection affirmed the importance of capsular serotype specific antibodies. This information, combined with that showing the efficacy of pneumococcal polysaccharide vaccine in adults, suggested that active immunisation of pregnant women with purified GBS polysaccharides could protect neonates and young infants. The premise was that if vaccination elicited protective levels of antibodies in childbearing age women, placental passage of these GBS CPS specific antibodies would protect neonates throughout the period of disease risk for invasive GBS infection (for example, the first 2–3 months of life).
Once the GBS three major serotypes that caused invasive GBS disease (Ia, II, and III) were structurally and immunochemically defined, there was a sense of expectation among investigators in the field. The first candidate GBS vaccine, a purified type III CPS, underwent phase 1 testing in healthy adults in 1978; subsequently type Ia and II CPS vaccines were studied. By contrast to the excellent immunogenicity observed in adults immunised with multivalent pneumococcal polysaccharide vaccine, type Ia, II, and III polysaccharides, while well tolerated, had uneven immunogenicity. Most adults (nearly 90%), it was discovered, had very low preimmunisation serum concentrations of CPS specific antibodies. These low levels, presumably indicating immunologic naivety to GBS polysaccharides, predicted a poor immune response in many, so that only 40% and 60%, respectively, developed significant increases in specific antibodies after immunisation with type Ia and III polysaccharides. By contrast, 88% of those immunised with type II CPS responded.8 In the few adults who presumably had been "primed" to GBS polysaccharides or related antigens (indicated by moderately increased serum concentrations of CPS specific antibodies), immunisation with type Ia, II, and III polysaccharides elicited brisk immune responses in nearly 100%.
The trials with GBS polysaccharide vaccines verified the feasibility of immunisation as an approach to prevent GBS disease and revealed the need to develop candidate vaccines with improved immunogencity. One encouragement to the ultimate success of a GBS vaccine programme was the first study conducted in pregnant women. Among responders to a type III GBS CPS vaccine administered at about 31 weeks of gestation, 90% had infants with substantial levels of III CPS specific antibodies in cord sera that promoted opsonisation and killing of type III GBS in vitro; this functional activity of infant sera persisted in the majority until age 3 months. Thus, in concept, maternal immunisation with an optimally immunogenic GBS vaccine during the third trimester should protect neonates and young infants from invasive GBS infection during the age of risk.9
THE CURRENT STATUS OF GBS CONJUGATE VACCINES
In the early 1990s a new GBS serotype, type V, emerged among cases in the USA and in other countries. A recent multicity active surveillance study of invasive GBS disease performed in a racially and ethnically diverse cohort of pregnant women and neonates noted that type V accounted for 23% and 14%, respectively, of maternal and early onset neonatal cases.10 The emergence of type V and an increasing number of nontypeable GBS isolates from colonised adults underscores the importance of ongoing epidemiologic investigations in formulating an appropriate multivalent GBS vaccine. Taken together, types Ia, III, and V GBS now account for at least 75%, and five serotypes (Ia, Ib, II, III, and V) for virtually 100% of GBS disease in infants and adults.11
Development of the first GBS conjugate vaccine, type III polysaccharide–tetanus toxoid, was driven by its prominence among infant isolates, especially those with meningitis and late onset infection with any clinical presentation. This type III CPS was covalently linked to monomeric tetanus toxoid using reductive amination coupling chemistry.12 All GBS conjugates to date were produced with this coupling chemistry, and with one exception, all studies to date have evaluated conjugates in healthy adults using tetanus toxoid as the protein carrier.
In the first clinical evaluation of a GBS conjugate, 100 women aged 18–40 years were randomised to receive either type III CPS–tetanus toxoid (III-TT) conjugate vaccine at one of three dosages, uncoupled III CPS, or placebo (saline).13 Each vaccine was well tolerated, and the predominant III CPS specific antibody isotype (>95%) elicited by immunisation was IgG. Although higher geometric mean CPS specific IgG levels were achieved in response to higher dosages of the conjugate, greater than fourfold rises were achieved in 90% of recipients of III-TT but in only 50% III CPS recipients (p = 0.0015). The III CPS specific IgG elicited by immunisation was functional in vitro and in protected neonatal mice from a lethal type III GBS challenge. Thus conjugation to TT significantly enhanced immunogenicity and indicated that prevention of perinatal GBS disease through maternal immunisation was potentially feasible.
Since 1996, conjugate vaccines to each of the clinically significant GBS serotypes causing invasive disease have been developed and tested in nearly 500 healthy young adults.14–17 Each of these vaccines has been well tolerated when given as a single intramuscular dose or as two doses. No serious vaccine associated events have occurred. Most recipients have had only mild to moderate tenderness at the injection site or no discernable symptoms or signs. Systemic reactions, consisting of low grade fever, chills, headache, or myalgias that resolved within 24–36 hours occurred in less than 2% of nearly 500 volunteers.
Dose-response testing has been performed for Ia, Ib, II, III, and V CPS-TT conjugates to determine the minimum dose that could be used in a multivalent vaccine (table 1). Such data are necessary to minimise the total amount of polysaccharide needed to stimulate a protective level of immunity and the rate of local reactions that appear to depend primarily on total tetanus carrier dose. Immune responses to GBS conjugates, with the exception of type V, are dose dependent. Doses of ~4 µg for type II CPS, 10 µg for type V, and ~15 µg for types Ia, Ib, and III CPS have elicited greater than fourfold increases in CPS specific IgG in 80–93% of volunteers eight weeks post-immunisation. For each serotype, conjugation has enhanced significantly immunogenicity when compared to uncoupled polysaccharides. Vaccine responses generally reach a peak four to eight weeks after immunisation and then decline. At one year after immunisation, the geometric mean concentration (GMC) of antibody is approximately 50% of the peak level. For example, subjects immunised with a 15 µg dose of type Ia CPS-TT have a GMC of 18.3 µg/ml at eight weeks after immunisation and 9.1 µg/ml at one year.14 Based on limited data at two years after immunisation, the GMC is still well above baseline, suggesting that as with other conjugate vaccines, the response to GBS conjugate vaccines is durable (Baker and colleagues14,15; also Baker et al, unpublished observations).
View this table:
[in this window]
[in a new window]
Table 1 Group B streptococcal CPS–TT conjugate vaccines
Functional activity has been tested in vitro with an opsonophagocytosis assay. For each serotype, positive correlations exist between killing of homologous GBS strains by human neutrophils after opsonisation by complement and concentration of conjugate vaccine induced CPS specific IgG.13–16 These findings suggest that GBS conjugates of a design similar to those already tested will be effective in GBS disease prevention. Table 1 summarises the immune responses to theoretically optimal dosages of each GBS conjugate vaccine tested in healthy adults and the proportion of disease in pregnant women and young infants (early and late onset disease) caused by the five serotypes. The magnitude of immune responses suggests that a single dose of a pentavalent GBS conjugate vaccine might be expected to have an efficacy of nearly 90%.
With a pentavalent vaccine as the goal, preliminary evaluation of a combination of types II-TT and III-TT vaccines has been conducted.17 This bivalent II/III CPS-TT conjugate vaccine was well tolerated in healthy adults and no immune interference was noted when compared to vaccinees who received a monovalent II-TT or III-TT conjugate. The bivalent vaccine stimulated immune responses comparable to those elicited by either of the monovalent conjugates. Another question of importance is whether a single dose of GBS conjugate vaccine will elicit an optimal response among a majority of recipients or whether a "booster" will be required. To address this, a group of healthy adults were given a second dose of III-TT vaccine 21 months after their initial immunisation.16 No increase in reactogenicity was observed, but the GMC of III CPS specific IgG eight weeks after the second dose was similar to that noted after the initial dose, indicating no discernable booster effect for the group as a whole. A small proportion of adults, some of these with the lowest preimmunisation antibody concentrations, did exhibit a "booster" response. Further studies will be required to prove the hypothesis that these individuals were truly naïve to the antigen, were "primed" with the first dose, and subsequently had an optimal response.
Two lots of type V conjugate vaccine have been tested in phase 1 clinical trials (Baker CJ, unpublished observations). The first used TT and the second the mutant diphtheria toxin, cross reactive material 197 (CRM197). The two conjugates were similarly well tolerated. Type V-TT recipients had slightly higher CPS specific IgG levels in their sera after immunisation than the V-CRM197 group, but the differences were not significant. These findings, using CRM197 as a protein carrier, are important because they affirm that more than one carrier can recruit the T cell help needed for an adequate immune response to a GBS polysaccharide.
As with the uncoupled GBS polysaccharide, a phase 1 trial in women at 32–34 weeks of gestation has just been completed.18 After randomisation, III-TT conjugate (12.5 µg dose of III CPS) or saline placebo was administered to 20 and 10 women, respectively. III CPS specific IgG concentrations were determined in maternal sera at delivery (at a mean of 8.3 weeks after immunisation), infant cord sera, and in sera obtained from infants at 1 and 2 months of age. GMCs in delivery sera from immunised women were significantly increased from preimmunisation values and correlated well (r = 0.93) with infant cord values. The actual GMCs in sera from infants of vaccinated women were 3.7 and 2.2 µg/ml, respectively, at 1 and 2 months of age. Sera from these infants of vaccinated women uniformly promoted opsonisation of type III GBS and killing by neutrophils in vitro. Thus, conjugate vaccine induced III CPS specific IgG was efficiently transported to the neonate and functions well in vitro, suggesting that a multivalent GBS conjugate vaccine has the potential for prevention of late as well as of early onset infant GBS disease, and possibly to effect a decrease in maternal invasive disease also.
BARRIERS TO LICENSURE OF GBS CONJUGATE VACCINES
Over two decades of investigation verifies the notion that maternal immunisation with a multivalent GBS conjugate vaccine is a valid approach to prevention of GBS disease in infancy. Published data indicate that candidate GBS polysaccharide–tetanus toxoid conjugates are safe in adults and elicit antibodies well above what is likely to be passively protective for neonates and young infants.19,20 The remaining scientific issue that must be answered for licensure is documentation of the efficacy of a GBS conjugate vaccine in a phase 3 trial. In order to facilitate such a trial, the formation of a corporate partnership with a pharmaceutical company would be desirable. There are concerns regarding such an undertaking. One obvious roadblock is a longstanding hesitancy to confront liability issues that surround immunisation of pregnant women. However, millions of doses of tetanus toxoid have been given to pregnant women without adverse effects.21 Since the GBS polysaccharides are simple sugars, it is difficult to conceive of their having other than a salutary effect on pregnant women and their fetuses when administered early in the third trimester. It has been suggested that an injury compensation programme, similar to those in effect for childhood immunisations, should be developed for maternal immunisation programmes to create an environment conducive for providers and encouraging to the vaccine industry.22 The formation, in the 1990s, of such public advocacy groups as the Group B Strep Association in the United States and the Canadian Group B Strep Association in Canada have fostered media attention on the importance of making vaccine prevention of GBS infection a reality.23 While other target populations, such as nonpregnant, childbearing age women and even adolescents, could be considered for immunisation, efficacy testing would not be practical in such populations. However, nonpregnant adults with defined medical conditions such as diabetes mellitus, chronic liver disease, and malignancy, or those more than 65 years of age would be reasonable target populations given their current invasive GBS disease burden.24–26 To date, almost no information exists regarding potentially protective CPS specific antibodies in these patients, whether other immune defence abnormalities render protective levels functionally inadequate, and if GBS conjugate are adequately immunogenic. The scientific evidence for maternal immunisation to prevent perinatal GBS disease is compelling. If perinatal GBS disease is to become, as with H influenzae type b disease in infants, a rarity, the time for pharmaceutical industry leadership is now.
REFERENCES
Centers for Disease Control and Prevention. Progress toward eliminating Hemophilus influenzae type b disease among infants and children—United States, 1987–1997. Morbid Mortal Weekly Rep 1998;47:993–8.[Medline]
Obaro S, Adegbola R. The pneumococcus: carriage, disease and conjugate vaccines. J Med Microbiol 2002;51:98–104.[Abstract/Free Full Text]
Schrag SJ, Zywicki S, Farley MM, et al. Group B streptococcal disease in the era of intrapartum antibiotic prophylaxis. N Engl J Med 2000;342:15–20.[Abstract/Free Full Text]
Fernandez M, Hickman ME, Baker CJ. Antimicrobial susceptibilities of group B streptococci isolated between 1992 and 1996 from patients with bacteremia or meningitis. Antimicrob Agent Chemother 1998;42:1517–19.[Abstract/Free Full Text]
Pearlman MD, Pierson CL, Faix RG. Frequent resistance of clinical group B streptococci isolates to clindamycin and erythromycin. Obstet Gynecol 1998;92:258–61.[Abstract]
Murdoch DR, Reller LB. Antimicrobial susceptibilities of group B streptococci isolated from patients with invasive disease: 10-year perspective. Antimicrob Agent Chemother 2001;45:3623–4.[Abstract/Free Full Text]
Baker CJ, Kasper DL. Correlation of maternal antibody deficiency with susceptibility to neonatal group B streptococcal infection. N Engl J Med 1976;294:753–6.[Abstract]
Baker CJ, Kasper DL. Group B streptococcal vaccines. Rev Infect Dis 1985;7:458–67.[Medline]
Baker CJ, Rench MA, Edwards MS, et al. Immunization of pregnant women with a polysaccharide vaccine of group B streptococcus. N Engl J Med 1988;319:1180–5.[Abstract]
Zaleznik DF, Rench MA, Hillier S, et al. Invasive disease due to group B streptococcus in pregnant women and neonates from diverse population groups. Clin Infect Dis 1999;30:276–81.
Harrison LH, Elliott JA, Dwyer DM, et al. Serotype distribution of invasive group B streptococcal isolates in Maryland: implications for vaccine formulation. J Infect Dis 1998;177:998–1002.[Medline]
Wessels MR, Paoletti LC, Kasper DL, et al. Immunogenicity in animals of a polysaccharide-protein conjugate vaccine against type III group B streptococcus. J Clin Invest 1990;86:1428–33.
Kasper DL, Paoletti LC, Wessels MR, et al. Immune response to type III group B streptococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. J Clin Invest 1996;98:2308–14.[Medline]
Baker CJ, Paoletti LC, Wessels MR, et al. Safety and immunogenicity of capsular polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccines for group B streptococcal types Ia and Ib. J Infect Dis 1999;179:142–50.[CrossRef][Medline]
Baker CJ, Paoletti LC, Rench MA, et al. Use of capsular polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine for type II group B streptococcus in healthy women. J Infect Dis 2000;182:1129–38.[CrossRef][Medline]
Paoletti LC, Rench MA, Kasper DL, et al. Effects of alum adjuvant or a booster dose on immunogenicity during clinical trials of group B streptococcal type III conjugate vaccines. Infect Immun 2001;69:6696–701.[Abstract/Free Full Text]
Fernandez M, Paoletti LC, Kasper DL, et al. Evaluation of a bivalent group B streptococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine [abstract 33]. Clin Infect Dis 1999;29:966.
Baker CJ, Rench MA, McInnes P. Safety and immunogenicity of group B streptococcal (GBS) type III capsular polysaccharide (CPS)-tetanus toxoid (III-TT) conjugate vaccine in pregnant women [abstract 370]. Clin Infect Dis 2001;33:1151.
Lin F-YC, Philips III JB, Azimi PH, et al. Level of maternal antibody required to protect neonates against early-onset disease caused by group B streptococcus type Ia: a multicenter seroepidemiology study. J Infect Dis 2001;184:1022–8.[CrossRef][Medline]
Baker CJ, Carey VJ, Edwards MS, et al. Quantity of maternal antibody at delivery that protects neonates from early-onset group B streptococcal disease. JAMA, submitted.
Whitman C, Belgharbi L, Gasse F, et al. Progress towards the global elimination of neonatal tetanus. World Health Stat Q 1992;45:248–56.[Medline]
Paradiso PR. Maternal immunization: the influence of liability issues on vaccine development. Vaccine 2002;20:S73–4.[CrossRef]
Schuchat A. Group B streptococcal disease: from trials and tribulations to triumph and trepidation. Clin Infect Dis 2001;33:751–6.[CrossRef][Medline]
Farley MM. Group B streptococcal disease in nonpregnant adults. Clin Infect Dis 2001;33:556–61.[CrossRef][Medline]
Muñoz P, Llancaqueo A, Rodríguez-Créixems M, et al. Group B streptococcus bacteremia in nonpregnant adults. Arch Intern Med 1997;157:213–16.[Abstract]
Henning KJ, Hall EL, Dwyer DM, et al. Invasive group B streptococcal disease in Maryland nursing home residents. J Infect Dis 2001;183:1138–42.[CrossRef][Medline] Группа B стрептококковый сопряженных вакцин
C J Бейкер, М S Эдвардс
Секция инфекционных болезней, кафедра педиатрии, Бейлор медицинский колледж, Хьюстон, Техас 77030, США
Корреспонденция на:
Корреспонденция на:
Д-р М. С. Эдвардс, Бейлор Медицинского колледжа, один Бейлор Plaza, комната 302A, Хьюстон, Техас 77030, США;
morvene@bcm.tmc.edu
Принято к публикации 5 октября 2002 года
АННОТАЦИЯ
Связь бактериальных капсульные полисахариды к белкам для создания вакцины, сопряженных оказал серьезное воздействие на здоровье детей. Хотя unconjugated полисахаридов плохо иммуногенность у детей и детей более старшего возраста и взрослых, их ковалентной связью с белками стимулирует Т-клеток зависит антигенных признание того, что серьезно повышает иммуногенность. За десятилетие с момента внедрения и широкого использования гемофилического гриппа типа B полисахаридной сопряженных вакцин в Соединенных Штатах, инвазивные H гриппа инфекции стали редкостью в childhood.1 также конъюгация полисахаридов из Streptococcus pneumoniae к производной от дифтерии анатоксином и Помимо пневмококковой вакцины сопряженных детской иммунизации графики несет в себе надежду на аналогичное снижение заболеваемости инвазивными пневмококковая болезнь в педиатрических patients.2
-------------------------------------------------- ------------------------------
Ключевые слова: вакцина; стрептококк
Сокращения: CPS, капсульные полисахаридной; GBS, стрептококк группы В; GMC, геометрической средней концентрации; МАГМП, intrapartum профилактику антибиотиками; ТТ, столбнячный анатоксин
Инвазивные болезни, вызванные стрептококк группы В (GBS), остается одной из основных причин смертности и заболеваемости новорожденных и младенцев. Несмотря на внедрение и широкое внедрение материнской intrapartum профилактику антибиотиками (IAP) в США с 1996 года, по оценкам 2200 новорожденных в течение первой недели жизни, и 1400 младенцев 7-89 дней возраста будут развиваться инвазивных GBS болезнь ежегодно; 140 из этих случаев будет fatal.3 матери МАГМП Хотя, безусловно, эффективным и привело к сокращению числа случаев раннего начала болезни почти на 75%, то в лучшем случае временным вмешательства, что не мешает всем раннего начала и не имеет никакого влияния на заболеваемость позднего начала GBS болезни. Например, начиная с 20-25% доставки женщин в США в настоящее время получают МАГМП, развитие резистентности к пенициллину среди GBS изолятах является обеспокоенность тем, что теоретически могло бы сделать это вмешательство неэффективно. Еще недавно, и значительного увеличения сопротивления эритромицин и клиндамицин среди GBS были задокументированы несколько групп investigators.4-6
Цель этого обзора состоит в том, чтобы представить обновленную информацию о состоянии GBS полисахаридной-белок сопряженных вакцин. Обзор представит обоснование для разработки вакцин, сопряженная GBS, нынешний статус клинических испытаний этих вакцин, а также перспективы для будущего использования GBS сопряженные вакцин.
ОБОСНОВАНИЕ GBS полисахаридной-БЕЛКА Conjugate ВАКЦИН
Защитную роль для антител к капсульные полисахаридной (CPS) типа III GBS был предсказан в 1970-е годы на Бейкера и Kasper.7 Эти следователи показали, что младенцы с инвазивными рано или поздно начала GBS болезни были рождены матерями с очень низкого уровня III CPS специфических антител в сыворотке при родах. Вывод о том, что человеческой сыворотки, содержащей достаточно концентрации ХП конкретные IgG способствовала эффективному opsonisation и фагоцитоз в пробирке и при условии защиты от смертоносной инфекции экспериментальных подтвердили важность капсульные серотипа специфических антител. Эта информация, наряду с указанием, что эффективность вакцины против пневмококковой полисахаридной у взрослых, считает, что активной иммунизации беременных женщин с помощью очищенного GBS полисахаридов может защитить новорожденных и младенцев. Посылка заключается в том, что при вакцинации вызвал защитные уровни антител в детородный возраст женщин, плацентарная прохождение этих GBS CPS специфических антител бы защитить новорожденных в течение всего периода болезни риск инвазивного GBS инфекции (например, первые 2-3 месяцев жизни) .
После GBS трех основных серотипов, что причиной заболевания инвазивные GBS (IA, II и III), были структурно и immunochemically определено, было чувство ожидания среди следователей на местах. Первым кандидатом GBS вакцины, чистый тип III CPS, прошел 1 этап тестирования у здоровых взрослых в 1978 году; впоследствии типа Ia и II УК вакцин были изучены. В отличие от отличная иммуногенность наблюдается у взрослых прививки с multivalent пневмококковая полисахаридной вакцины типа Ia, II, III и полисахаридов, в то время как хорошо, был неравномерным иммуногенности. Большинство взрослых (около 90%), было обнаружено, были очень низкими preimmunisation сывороточной концентрации ХП специфических антител. Эти низкие уровни, предположительно, с указанием иммунологические наивность для GBS полисахариды, предсказал бедных иммунный ответ на многие, так что только 40% и 60% соответственно, разработал значительное увеличение специфических антител после иммунизации типа Ia и III полисахариды. Напротив, 88% тех, кто привит типа II УК responded.8 В нескольких взрослых, которые предположительно были "инициированы" на GBS полисахаридов или смежных антигены (обозначается значком умеренно увеличить сывороточной концентрации специфических антител CPS), иммунизация типа Ia, II, III и полисахаридов вызвала оживленный иммунных реакций в почти 100%.
Судебных процессов с GBS полисахаридной вакцины проверены возможности иммунизации в качестве подхода к предупреждению GBS болезнью и выявили необходимость в разработке вакцин-кандидатов с улучшенными immunogencity. Один стимулом для конечного успеха GBS вакцины программа стала первым исследование, проведенное среди беременных женщин. Среди респондентов с типом III GBS CPS вакцины в ведении около 31 недель беременности, 90% имели детей, со значительным уровнем III CPS специфических антител в сыворотке мозга, которые поощряют opsonisation и убийство тип III GBS в пробирке, что функциональная активность младенческой сыворотки сохраняется в большинстве возрасте до 3 месяцев. Таким образом, в концепции, материнской Immunisation с оптимальным GBS иммуногенность вакцины в течение третьего триместра должна защитить новорожденных и младенцев от инвазивных GBS инфекции в эпоху risk.9
Нынешний статус GBS Conjugate ВАКЦИН
В начале 1990-х годов новая GBS серотипа, типа V, возникли среди случаев в США и в других странах. В недавнем multicity Активные эпиднадзору исследование инвазивных GBS заболевания осуществляется в расово и этнически разнообразный контингент беременных и новорожденных, отметили, что тип V составляли 23% и 14% соответственно, материнской и ранней неонатальной начала cases.10 Появление типа V, и все большее число nontypeable GBS изоляты из colonised взрослых подчеркивает важность постоянного эпидемиологического расследования в разработке соответствующих multivalent GBS вакцины. Взятые вместе, типы Ia, III и V GBS в настоящее время составляют не менее 75%, а пять серотипов (Ia, Ib, II, III и V) практически для 100% GBS заболеваний у младенцев и adults.11
Разработка первого GBS сопряженных вакцины, тип III полисахаридной-столбнячного анатоксина, было обусловлено его известность среди младенцев изолирует, особенно с менингитом и поздним началом любой инфекции клинические проявления. Этот тип III CPS был ковалентно связаны с мономерные столбняка анатоксином с использованием редуктивных amination сцепления chemistry.12 Все GBS конъюгатов на сегодняшний день было произведено с этой связью химии, а также с одним исключением, все исследования, на сегодняшний день оценивается в конъюгатов здоровых взрослых людей, используя в качестве столбнячный анатоксин белка перевозчика.
В первой клинической оценке сопряженных GBS, 100 женщин в возрасте 18-40 лет были Рандомизированные для получения любого типа III CPS-столбнячный анатоксин (III-TT) сопряжение вакцин в одной из трех доз, расцепкой III CPS, либо плацебо (соленые) .13 каждой вакцины было хорошо, и преобладает III CPS конкретных антител isotype (> 95%) получили по иммунизации была IgG. Хотя высшее среднее геометрическое CPS IgG конкретные уровни были достигнуты в ответ на высокие дозы от сопряженных более чем в четыре раза повышается были достигнуты в 90% получателей III-TT, но только 50% получателей CPS III (P = 0,0015). III CPS конкретных IgG вызвал к иммунизации является функциональным в пробирке и в охраняемых новорожденных мышей от смертоносного вида III GBS задачей. Таким образом, сопряжение с ТТ значительно расширенной иммуногенность и отметил, что профилактика перинатальной GBS болезней путем иммунизации матери потенциально возможным.
Начиная с 1996 года, сопряженных с вакцинами каждый из клинически значимых GBS серотипы причинение инвазивных заболеваний были разработаны и испытаны в почти 500 здоровых молодых adults.14-17 Каждая из этих вакцин было хорошо, когда с учетом как единый внутримышечная дозу или две дозы . Отсутствие серьезных вакцина связанные события произошли. Большинство получателей были лишь легкой до умеренной болезненность в месте инъекции или нет заметных симптомов или признаков. Системные реакции, состоящей из низкосортных лихорадка, озноб, головная боль, или myalgias чтобы решить в течение 24-36 часов произошло менее чем на 2% из почти 500 добровольцев.
"Доза-реакция" испытание было проведено для Ia, Ib, II, III, V и CPS-TT конъюгатов для определения минимальных доз, которые могут быть использованы в multivalent вакцины (таблица 1). Такие данные необходимы для сведения к минимуму общую сумму полисахарид, необходимых для стимулирования защитных уровень иммунитета и ставки местных реакций, которые, как представляется, в первую очередь зависит от общей дозы столбняка перевозчика. Иммунный ответ на GBS конъюгатов, за исключением типа V, являются дозы зависят. Дозы ~ 4 мкг по типу II CPS, 10 мкг для типа V, и ~ 15 мкг типов Ia, Ib и III CPS вызвали более чем четырехкратное увеличение CPS конкретных IgG в 80-93% добровольцев, восемь недель после Прививки. Для каждого серотипа, конъюгация значительно расширила иммуногенность сравнению с расцепкой полисахаридов. Вакцина ответов в целом достигнет пика в четыре-восемь недель после иммунизации, а затем спад. На один год после иммунизации, геометрической средней концентрации (GMC) антител составляет примерно 50% от пикового уровня. Например, предметы привит с 15 мкг доза типа Ia CPS-TT имеют GMC от 18.3 мкг / мл на восемь недель после иммунизации и 9,1 мкг / мл в одном year.14 основе ограниченных данных на двух лет после иммунизации, GMC по-прежнему значительно выше базового уровня, что, как сопряженная с другими вакцинами, в ответ на GBS сопряженные вакцин прочного (Бейкер и colleagues14, 15; также Бейкер и др., неопубликованные наблюдения).
Просмотр этой таблицы:
[в окне]
[в новом окне]
Таблица 1 Группа B стрептококковый CPS-TT сопряженных вакцин
Функциональная активность была испытана в пробирке с opsonophagocytosis тесте. Для каждого серотипа, положительные корреляции между убийством гомологичная GBS штаммов человеческого нейтрофилов после opsonisation путем дополнения и концентрация сопряженных вакцинального CPS конкретных IgG.13-16 Эти выводы свидетельствуют о том, что GBS конъюгаты дизайн, аналогичные тем, которые уже прошли проверку, будут эффективными GBS в профилактике болезней. Таблица 1 суммирует иммунных ответов на теоретически оптимальную дозировку каждого GBS сопряженных испытания вакцины у здоровых взрослых и доля заболеваний у беременных женщин и младенцев (в начале и в конце начала заболевания) в результате пять серотипов. Масштабы иммунных ответов свидетельствует о том, что одна доза пятивалентной GBS сопряженных вакцина, возможно, предстоит сыграть эффективность около 90%.
Что пятивалентной вакцины в качестве цели, предварительная оценка сочетания типов II-III TT и TT-вакцины было conducted.17 Это двухвалентный II / III CPS-TT сопряженных вакцины было хорошо у здоровых взрослых и иммунной вмешательство не было отмечено По сравнению с вакцинированными, кто получил моновалентной TT-II или III-TT сопряженные. Двухвалентной вакцины стимулирует иммунный ответ, сопоставимые с теми вызвал одним из моновалентной конъюгатов. Другим важным вопросом является ли одна доза вакцины GBS сопряженных будет получить оптимальный ответ среди большинства получателей, или же "бустер" будет необходимо. Для решения этой проблемы группа здоровых взрослых, получили вторую дозу III-TT вакцины 21 месяцев после своего первоначального immunisation.16 Нет увеличением реактогенность был замечен, а в III GMC CPS конкретных IgG восемь недель после второй дозы был аналогичен в том, что заметил, что после первоначальной дозы, что указывает не щейся бустер эффект для группы в целом. Небольшая доля взрослого населения, некоторые из них с наименьшими preimmunisation концентрации антител, сделали выставку "бустер" ответ. Дальнейшие исследования необходимо будет доказать гипотезу о том, что эти люди действительно наивно антиген, были "инициированы" с первой дозы, а затем был оптимальный ответ.
Две партии типа V сопряженных вакцины были испытаны в фазу 1 клинических испытаний (CJ Бейкер, неопубликованные наблюдения). Впервые использован TT и второй мутант токсина дифтерии, кросс реактивных материалов 197 (CRM197). Два конъюгаты были также хорошо. Тип V-TT получателей были немного выше, CPS конкретные уровни IgG в сыворотке после иммунизации, чем V-CRM197 группе, но различия не были значительными. Эти выводы, используя CRM197 как белка перевозчика, являются важными, поскольку они подтверждают, что более чем на один перевозчик может нанять Т-клеток помощь, необходимую для адекватного иммунного ответа на GBS полисахарида.
Как и в случае с расцепкой GBS полисахарид, 1 этап судебного разбирательства у женщин на 32-34 неделе беременности был только что completed.18 После randomisation, III-TT сопряженных (12.5 мкг доза III CPS) или соленых плацебо под управлением 20 и 10 женщин, соответственно. III CPS конкретной концентрации IgG определяли в сыворотке матери при родах (в среднем 8,3 недель после иммунизации), младенческой шнур сывороток и сывороток получить младенцев на 1 и 2-месячного возраста. GMCS на поставку сыворотки от прививки женщин было значительно увеличено с preimmunisation ценности и хорошо коррелировала (р = 0.93), с младенческого мозга ценностей. Фактическое GMCS в сывороток от вакцинированных детей, женщин было 3,7 и 2,2 мкг / мл, соответственно, на 1 и 2-месячного возраста. Сера из этих детей, вакцинированных женщин одинаково способствовали opsonisation типа III GBS и убийств нейтрофилов в пробирке. Таким образом, сопряженных вакцинального III CPS конкретных IgG было эффективно транспортироваться на новорожденных и функции также в пробирке, что multivalent GBS сопряженных вакцина обладает потенциалом для предотвращения конца, а также раннего начала GBS детская болезнь, и, возможно, в силу сокращение уровня материнской инвазивных заболеваний также.
БАРЬЕРЫ НА лицензирования GBS Conjugate ВАКЦИН
Более двух десятилетий исследование подтверждает идею о том, что иммунизация матерей с multivalent GBS сопряженных вакцины является действенным подходом к профилактике заболеваний GBS в зачаточном состоянии. Опубликованные данные свидетельствуют о том, что кандидат GBS полисахаридной-столбнячный анатоксин конъюгатов безопасны у взрослых и получения антител гораздо выше того, что, скорее всего, будет пассивно защитные для новорожденных и молодых infants.19, 20 оставшихся научных вопросов, которые необходимо ответить для лицензирования является документирование Эффективность GBS сопряженных вакцины в 3 этапа судебного разбирательства. В целях облегчения такого судебного процесса, формирование корпоративного партнерства с фармацевтической компанией, было бы желательным. Существуют опасения в отношении таких обязательств. Одним из очевидных дорожное является давним нерешительность противостоять ответственности вопросов, которые окружают иммунизации беременных женщин. Тем не менее, миллионы доз столбнячного анатоксина были беременные женщины, не имеющие негативного effects.21 С GBS полисахариды являются простыми сахарами, то трудно представить себе что они, помимо благотворного воздействия на беременных женщин и их плодов при ведении в начале третьего триместра. Было высказано мнение, что компенсация вреда программы, аналогичные тем, которые действуют в детстве прививки, должны быть разработаны для иммунизации матери программ по созданию благоприятных условий для провайдеров и призывая к вакцине industry.22 образование, в 1990-х годов, таких Информационно-пропагандистская деятельность групп, как Группа B Strep ассоциации в Соединенных Штатах Америки и канадской группы B Strep ассоциация в Канаде способствовали средства массовой информации внимание на важность принятия вакцины предотвращения GBS инфекции reality.23 Хотя другие целевые группы населения, такие, как nonpregnant, фертильном возраст женщины и даже подростки, могут быть рассмотрены по иммунизации, эффективности тестирования не будет носить практический характер в таких групп населения. Вместе с тем, nonpregnant взрослые с определенными медицинскими показаниями, таких, как сахарный диабет, хронические заболевания печени и злокачественных, или тех, более чем 65-летнего возраста, будет разумным целевых групп населения с учетом их нынешнего инвазивных GBS болезни burden.24-26 На сегодняшний день практически нет информации Имеющиеся в отношении потенциально CPS защитных специфических антител в эти пациенты, независимо от того, другие иммунную защиту аномалии делают защитные уровни функционально недостаточным, и если GBS сопряженных адекватно иммуногенность. Научные доказательства материнской Прививки для предотвращения перинатальной GBS болезнь убедительной. Если перинатальной GBS болезни заключается в том, чтобы стать, как и в H гриппа типа B заболеваний у детей, редко, времени для фармацевтической промышленности в настоящее время руководство.
ОТЗЫВЫ
Центры по контролю и профилактике заболеваний. Прогресс в направлении ликвидации Hemophilus гриппа типа B болезнью среди грудных детей и детей-Соединенные Штаты Америки, 1987-1997 годы. Morbid Mortal Еженедельник Rep 1998; 47:993-8. [Medline]
Obaro S, Adegbola Р. пневмококк: перевозки, болезней и сопряженного вакцин. J Med Microbiol 2002; 51:98-104. [Аннотация / Свободный Полный текст]
Schrag SJ, Zywicki S, Фарли М., и др.. Группа B стрептококковой инфекции в эру intrapartum профилактику антибиотиками. N Engl J Med 2000; 342:15-20. [Аннотация / Свободный Полный текст]
Фернандес М, Hickman ME, Бейкер CJ. Противомикробные восприимчивостей группы B стрептококки изолированных между 1992 и 1996 годах у пациентов с бактериемией или менингит. Antimicrob Агент Chemother 1998; 42:1517-19. [Аннотация / Свободный Полный текст]
Pearlman MD, Пирсон CL, Faix RG. Частые сопротивление клинической группе B стрептококки изолятов на клиндамицин и эритромицин. Obstet Gynecol 1998; 92:258-61. [Аннотация]
Д. Р. Мердок, Reller LB. Противомикробные восприимчивостей группы B стрептококки изолированных от пациентов с инвазивным болезни: 10-летнюю перспективу. Antimicrob Агент Chemother 2001; 45:3623-4. [Аннотация / Свободный Полный текст]
Бейкер CJ, Каспер DL. Соотношение дефицита антител матери с новорожденным восприимчивость к группе B стрептококковой инфекцией. N Engl J Med 1976; 294:753-6. [Аннотация]
Бейкер CJ, Каспер DL. Группа B стрептококковый вакцин. Rev Infect Дисе 1985; 7:458-67. [Medline]
Бейкер CJ, RENCH М.А., Эдвардс М.С., и др.. Иммунизация беременных женщин с полисахаридной вакцины от группы B стрептококк. N Engl J Med 1988; 319:1180-5. [Аннотация]
Zaleznik DF, RENCH М.А., Хиллиер S, и др.. Инвазивные болезни вследствие стрептококк группы В у беременных женщин и новорожденных из различных групп населения. Clin Infect Дисе 1999; 30:276-81.
Харрисон LH, Elliott JA, Дуайер Д.М., и др.. Серотип распространения инвазивных группы B стрептококковый изолятах в Мэриленд: последствия для разработки вакцины. J Infect Дисе 1998; 177:998-1002. [Medline]
Wessels М.Р., Paoletti LC, Каспер DL, и др.. Иммуногенности в животных полисахарид-белок сопряженных вакцина против типа III группы B стрептококк. J Clin Инвест 1990; 86:1428-33.
Каспер DL, Paoletti LC, Wessels М.Р., и др.. Иммунный ответ на тип III группы B стрептококковый полисахаридной-столбнячный анатоксин сопряженных вакцины. J Clin Инвест 1996; 98:2308-14. [Medline]
Бейкер CJ, Paoletti LC, Wessels М.Р., и др.. Безопасности и иммуногенности капсульные полисахаридной-столбнячный анатоксин сопряженных вакцин для группы B стрептококковый типов Ia и Ib. J Infect Дисе 1999; 179:142-50. [CrossRef] [Medline]
Бейкер CJ, Paoletti LC, RENCH М.А., и др.. Использование капсульные полисахаридной-столбнячный анатоксин сопряженных вакцина для типа II группы B стрептококк у здоровых женщин. J Infect Дисе 2000; 182:1129-38. [CrossRef] [Medline]
Paoletti LC, RENCH М.А., Каспер DL, и др.. Действие квасцов адъювант или бустерные дозы на иммуногенность во время клинических испытаний в группе B стрептококковый тип III сопряженных вакцин. Infect иммунизации 2001; 69:6696-701. [Аннотация / Свободный Полный текст]
Фернандес М, Paoletti LC, Каспер DL, и др.. Оценка двухвалентный группу B стрептококковый полисахаридной-столбнячный анатоксин сопряженных вакцины [аннотация 33]. Clin Infect Дисе 1999; 29:966.
Бейкер CJ, RENCH М.А., Макиннес П. безопасности и иммуногенности стрептококками группы В (GBS) тип III капсульные полисахаридной (CPS)-столбнячный анатоксин (III-TT) сопряжение вакцины у беременных женщин [аннотация 370]. Clin Infect Дисе 2001; 33:1151.
Линь F-YC, Philips III JB, Азими PH, и др.. Уровень материнской антител, необходимых для защиты новорожденных от раннего начала болезни, вызванные группы B стрептококк типа Ia: многоцентровыми seroepidemiology исследования. J Infect Дисе 2001; 184:1022-8. [CrossRef] [Medline]
Бейкер CJ, Carey VJ, Эдвардс М.С., и др.. Количество антител матери при родах, который защищает новорожденных от раннего начала группы B стрептококкового заболевания. JAMA, который был представлен.
Уитман C, L Belgharbi, Gasse F, и др.. Прогресс в достижении глобальной ликвидации столбняка у новорожденных. Мир Здоровье Стат Q 1992; 45:248-56. [Medline]
Paradiso PR. Материнская вакцинации: влияние ответственности вопросам разработки вакцины. Вакцина 2002, 20: S73-4. [CrossRef]
Schuchat A. Группа B стрептококковый болезней: от испытаний и невзгод с триумфом и трепетом. Clin Infect Дисе 2001; 33:751-6. [CrossRef] [Medline]
Фарли ММ. Группа B стрептококкового заболевания в nonpregnant взрослых. Clin Infect Дисе 2001; 33:556-61. [CrossRef] [Medline]
Муньоса P, Llancaqueo, Родригес-Créixems М, и др.. Группа B стрептококк бактериемия в nonpregnant взрослых. Arch Стажер Med 1997; 157:213-16. [Аннотация]
Хеннинг KJ, зал Е.Л., Дуайер Д.М., и др.. Инвазивные группы B стрептококкового заболевания в Мэриленде доме престарелых жителей. J Infect Дисе 2001; 183:1138-42. [CrossRef] [Medline]
английский > русский поменятьПеревести
Group B streptococcal conjugate vaccines
C J Baker, M S Edwards
Section of Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas 77030, USA
Correspondence to:
Correspondence to:
Dr M S Edwards, Baylor College of Medicine, One Baylor Plaza, Room 302A, Houston, Texas 77030, USA;
morvene@bcm.tmc.edu
Accepted for publication 5 October 2002
ABSTRACT
Linkage of bacterial capsular polysaccharides to proteins to create conjugate vaccines has had a dramatic impact on the health of children. Although unconjugated polysaccharides are poorly immunogenic in infants and some older children and adults, their covalent coupling with proteins stimulates T cell dependent antigenic recognition that profoundly enhances immunogenicity. In the decade since the introduction and widespread use of Haemophilus influenzae type b polysaccharide conjugate vaccines in the United States, invasive H influenzae infections have become a rarity in childhood.1 Similarly, the conjugation of polysaccharides of Streptococcus pneumoniae to a derivative of diphtheria toxoid and the addition of pneumococcal conjugate vaccine to infant immunisation schedules carries with it promise for a similar decline in the incidence of invasive pneumococcal disease in paediatric patients.2
--------------------------------------------------------------------------------
Keywords: vaccine; streptococcus
Abbreviations: CPS, capsular polysaccharide; GBS, group B streptococcus; GMC, geometric mean concentration; IAP, intrapartum antibiotic prophylaxis; TT, tetanus toxoid
Invasive disease caused by group B streptococcus (GBS) remains a major cause of mortality and morbidity in neonates and young infants. Despite the introduction and widespread implementation of maternal intrapartum antibiotic prophylaxis (IAP) in the USA since 1996, an estimated 2200 neonates during the first week of life and 1400 infants 7–89 days of age will develop invasive GBS disease annually; 140 of these cases will be fatal.3 While maternal IAP is unquestionably effective and has reduced the incidence of early onset disease by nearly 75%, it is at best an interim intervention that does not prevent all early onset and has no influence on the incidence of late onset GBS disease. For example, since 20–25% of delivering women in the USA currently are receiving IAP, the development of penicillin resistance among GBS isolates is a concern that theoretically could render this intervention ineffective. Already a recent and substantial increase in resistance to erythromycin and clindamycin among GBS has been documented by several groups of investigators.4–6
The intent of this review is to provide an update on the status of GBS polysaccharide–protein conjugate vaccines. The review will present the rationale for the development of GBS conjugate vaccines, the current status of clinical trials with these vaccines, and prospects for the future use of GBS conjugate vaccines.
THE RATIONALE FOR GBS POLYSACCHARIDE–PROTEIN CONJUGATE VACCINES
A protective role for antibodies to the capsular polysaccharide (CPS) of type III GBS was predicted in the 1970s by Baker and Kasper.7 These investigators showed that infants with invasive early or late onset GBS disease were born to mothers with very low levels of III CPS specific antibodies in sera at delivery. The finding that human sera containing a sufficient concentration of CPS specific IgG promoted efficient opsonisation and phagocytosis in vitro and provided protection from lethal experimental infection affirmed the importance of capsular serotype specific antibodies. This information, combined with that showing the efficacy of pneumococcal polysaccharide vaccine in adults, suggested that active immunisation of pregnant women with purified GBS polysaccharides could protect neonates and young infants. The premise was that if vaccination elicited protective levels of antibodies in childbearing age women, placental passage of these GBS CPS specific antibodies would protect neonates throughout the period of disease risk for invasive GBS infection (for example, the first 2–3 months of life).
Once the GBS three major serotypes that caused invasive GBS disease (Ia, II, and III) were structurally and immunochemically defined, there was a sense of expectation among investigators in the field. The first candidate GBS vaccine, a purified type III CPS, underwent phase 1 testing in healthy adults in 1978; subsequently type Ia and II CPS vaccines were studied. By contrast to the excellent immunogenicity observed in adults immunised with multivalent pneumococcal polysaccharide vaccine, type Ia, II, and III polysaccharides, while well tolerated, had uneven immunogenicity. Most adults (nearly 90%), it was discovered, had very low preimmunisation serum concentrations of CPS specific antibodies. These low levels, presumably indicating immunologic naivety to GBS polysaccharides, predicted a poor immune response in many, so that only 40% and 60%, respectively, developed significant increases in specific antibodies after immunisation with type Ia and III polysaccharides. By contrast, 88% of those immunised with type II CPS responded.8 In the few adults who presumably had been "primed" to GBS polysaccharides or related antigens (indicated by moderately increased serum concentrations of CPS specific antibodies), immunisation with type Ia, II, and III polysaccharides elicited brisk immune responses in nearly 100%.
The trials with GBS polysaccharide vaccines verified the feasibility of immunisation as an approach to prevent GBS disease and revealed the need to develop candidate vaccines with improved immunogencity. One encouragement to the ultimate success of a GBS vaccine programme was the first study conducted in pregnant women. Among responders to a type III GBS CPS vaccine administered at about 31 weeks of gestation, 90% had infants with substantial levels of III CPS specific antibodies in cord sera that promoted opsonisation and killing of type III GBS in vitro; this functional activity of infant sera persisted in the majority until age 3 months. Thus, in concept, maternal immunisation with an optimally immunogenic GBS vaccine during the third trimester should protect neonates and young infants from invasive GBS infection during the age of risk.9
THE CURRENT STATUS OF GBS CONJUGATE VACCINES
In the early 1990s a new GBS serotype, type V, emerged among cases in the USA and in other countries. A recent multicity active surveillance study of invasive GBS disease performed in a racially and ethnically diverse cohort of pregnant women and neonates noted that type V accounted for 23% and 14%, respectively, of maternal and early onset neonatal cases.10 The emergence of type V and an increasing number of nontypeable GBS isolates from colonised adults underscores the importance of ongoing epidemiologic investigations in formulating an appropriate multivalent GBS vaccine. Taken together, types Ia, III, and V GBS now account for at least 75%, and five serotypes (Ia, Ib, II, III, and V) for virtually 100% of GBS disease in infants and adults.11
Development of the first GBS conjugate vaccine, type III polysaccharide–tetanus toxoid, was driven by its prominence among infant isolates, especially those with meningitis and late onset infection with any clinical presentation. This type III CPS was covalently linked to monomeric tetanus toxoid using reductive amination coupling chemistry.12 All GBS conjugates to date were produced with this coupling chemistry, and with one exception, all studies to date have evaluated conjugates in healthy adults using tetanus toxoid as the protein carrier.
In the first clinical evaluation of a GBS conjugate, 100 women aged 18–40 years were randomised to receive either type III CPS–tetanus toxoid (III-TT) conjugate vaccine at one of three dosages, uncoupled III CPS, or placebo (saline).13 Each vaccine was well tolerated, and the predominant III CPS specific antibody isotype (>95%) elicited by immunisation was IgG. Although higher geometric mean CPS specific IgG levels were achieved in response to higher dosages of the conjugate, greater than fourfold rises were achieved in 90% of recipients of III-TT but in only 50% III CPS recipients (p = 0.0015). The III CPS specific IgG elicited by immunisation was functional in vitro and in protected neonatal mice from a lethal type III GBS challenge. Thus conjugation to TT significantly enhanced immunogenicity and indicated that prevention of perinatal GBS disease through maternal immunisation was potentially feasible.
Since 1996, conjugate vaccines to each of the clinically significant GBS serotypes causing invasive disease have been developed and tested in nearly 500 healthy young adults.14–17 Each of these vaccines has been well tolerated when given as a single intramuscular dose or as two doses. No serious vaccine associated events have occurred. Most recipients have had only mild to moderate tenderness at the injection site or no discernable symptoms or signs. Systemic reactions, consisting of low grade fever, chills, headache, or myalgias that resolved within 24–36 hours occurred in less than 2% of nearly 500 volunteers.
Dose-response testing has been performed for Ia, Ib, II, III, and V CPS-TT conjugates to determine the minimum dose that could be used in a multivalent vaccine (table 1). Such data are necessary to minimise the total amount of polysaccharide needed to stimulate a protective level of immunity and the rate of local reactions that appear to depend primarily on total tetanus carrier dose. Immune responses to GBS conjugates, with the exception of type V, are dose dependent. Doses of ~4 µg for type II CPS, 10 µg for type V, and ~15 µg for types Ia, Ib, and III CPS have elicited greater than fourfold increases in CPS specific IgG in 80–93% of volunteers eight weeks post-immunisation. For each serotype, conjugation has enhanced significantly immunogenicity when compared to uncoupled polysaccharides. Vaccine responses generally reach a peak four to eight weeks after immunisation and then decline. At one year after immunisation, the geometric mean concentration (GMC) of antibody is approximately 50% of the peak level. For example, subjects immunised with a 15 µg dose of type Ia CPS-TT have a GMC of 18.3 µg/ml at eight weeks after immunisation and 9.1 µg/ml at one year.14 Based on limited data at two years after immunisation, the GMC is still well above baseline, suggesting that as with other conjugate vaccines, the response to GBS conjugate vaccines is durable (Baker and colleagues14,15; also Baker et al, unpublished observations).
View this table:
[in this window]
[in a new window]
Table 1 Group B streptococcal CPS–TT conjugate vaccines
Functional activity has been tested in vitro with an opsonophagocytosis assay. For each serotype, positive correlations exist between killing of homologous GBS strains by human neutrophils after opsonisation by complement and concentration of conjugate vaccine induced CPS specific IgG.13–16 These findings suggest that GBS conjugates of a design similar to those already tested will be effective in GBS disease prevention. Table 1 summarises the immune responses to theoretically optimal dosages of each GBS conjugate vaccine tested in healthy adults and the proportion of disease in pregnant women and young infants (early and late onset disease) caused by the five serotypes. The magnitude of immune responses suggests that a single dose of a pentavalent GBS conjugate vaccine might be expected to have an efficacy of nearly 90%.
With a pentavalent vaccine as the goal, preliminary evaluation of a combination of types II-TT and III-TT vaccines has been conducted.17 This bivalent II/III CPS-TT conjugate vaccine was well tolerated in healthy adults and no immune interference was noted when compared to vaccinees who received a monovalent II-TT or III-TT conjugate. The bivalent vaccine stimulated immune responses comparable to those elicited by either of the monovalent conjugates. Another question of importance is whether a single dose of GBS conjugate vaccine will elicit an optimal response among a majority of recipients or whether a "booster" will be required. To address this, a group of healthy adults were given a second dose of III-TT vaccine 21 months after their initial immunisation.16 No increase in reactogenicity was observed, but the GMC of III CPS specific IgG eight weeks after the second dose was similar to that noted after the initial dose, indicating no discernable booster effect for the group as a whole. A small proportion of adults, some of these with the lowest preimmunisation antibody concentrations, did exhibit a "booster" response. Further studies will be required to prove the hypothesis that these individuals were truly naïve to the antigen, were "primed" with the first dose, and subsequently had an optimal response.
Two lots of type V conjugate vaccine have been tested in phase 1 clinical trials (Baker CJ, unpublished observations). The first used TT and the second the mutant diphtheria toxin, cross reactive material 197 (CRM197). The two conjugates were similarly well tolerated. Type V-TT recipients had slightly higher CPS specific IgG levels in their sera after immunisation than the V-CRM197 group, but the differences were not significant. These findings, using CRM197 as a protein carrier, are important because they affirm that more than one carrier can recruit the T cell help needed for an adequate immune response to a GBS polysaccharide.
As with the uncoupled GBS polysaccharide, a phase 1 trial in women at 32–34 weeks of gestation has just been completed.18 After randomisation, III-TT conjugate (12.5 µg dose of III CPS) or saline placebo was administered to 20 and 10 women, respectively. III CPS specific IgG concentrations were determined in maternal sera at delivery (at a mean of 8.3 weeks after immunisation), infant cord sera, and in sera obtained from infants at 1 and 2 months of age. GMCs in delivery sera from immunised women were significantly increased from preimmunisation values and correlated well (r = 0.93) with infant cord values. The actual GMCs in sera from infants of vaccinated women were 3.7 and 2.2 µg/ml, respectively, at 1 and 2 months of age. Sera from these infants of vaccinated women uniformly promoted opsonisation of type III GBS and killing by neutrophils in vitro. Thus, conjugate vaccine induced III CPS specific IgG was efficiently transported to the neonate and functions well in vitro, suggesting that a multivalent GBS conjugate vaccine has the potential for prevention of late as well as of early onset infant GBS disease, and possibly to effect a decrease in maternal invasive disease also.
BARRIERS TO LICENSURE OF GBS CONJUGATE VACCINES
Over two decades of investigation verifies the notion that maternal immunisation with a multivalent GBS conjugate vaccine is a valid approach to prevention of GBS disease in infancy. Published data indicate that candidate GBS polysaccharide–tetanus toxoid conjugates are safe in adults and elicit antibodies well above what is likely to be passively protective for neonates and young infants.19,20 The remaining scientific issue that must be answered for licensure is documentation of the efficacy of a GBS conjugate vaccine in a phase 3 trial. In order to facilitate such a trial, the formation of a corporate partnership with a pharmaceutical company would be desirable. There are concerns regarding such an undertaking. One obvious roadblock is a longstanding hesitancy to confront liability issues that surround immunisation of pregnant women. However, millions of doses of tetanus toxoid have been given to pregnant women without adverse effects.21 Since the GBS polysaccharides are simple sugars, it is difficult to conceive of their having other than a salutary effect on pregnant women and their fetuses when administered early in the third trimester. It has been suggested that an injury compensation programme, similar to those in effect for childhood immunisations, should be developed for maternal immunisation programmes to create an environment conducive for providers and encouraging to the vaccine industry.22 The formation, in the 1990s, of such public advocacy groups as the Group B Strep Association in the United States and the Canadian Group B Strep Association in Canada have fostered media attention on the importance of making vaccine prevention of GBS infection a reality.23 While other target populations, such as nonpregnant, childbearing age women and even adolescents, could be considered for immunisation, efficacy testing would not be practical in such populations. However, nonpregnant adults with defined medical conditions such as diabetes mellitus, chronic liver disease, and malignancy, or those more than 65 years of age would be reasonable target populations given their current invasive GBS disease burden.24–26 To date, almost no information exists regarding potentially protective CPS specific antibodies in these patients, whether other immune defence abnormalities render protective levels functionally inadequate, and if GBS conjugate are adequately immunogenic. The scientific evidence for maternal immunisation to prevent perinatal GBS disease is compelling. If perinatal GBS disease is to become, as with H influenzae type b disease in infants, a rarity, the time for pharmaceutical industry leadership is now.
REFERENCES
Centers for Disease Control and Prevention. Progress toward eliminating Hemophilus influenzae type b disease among infants and children—United States, 1987–1997. Morbid Mortal Weekly Rep 1998;47:993–8.[Medline]
Obaro S, Adegbola R. The pneumococcus: carriage, disease and conjugate vaccines. J Med Microbiol 2002;51:98–104.[Abstract/Free Full Text]
Schrag SJ, Zywicki S, Farley MM, et al. Group B streptococcal disease in the era of intrapartum antibiotic prophylaxis. N Engl J Med 2000;342:15–20.[Abstract/Free Full Text]
Fernandez M, Hickman ME, Baker CJ. Antimicrobial susceptibilities of group B streptococci isolated between 1992 and 1996 from patients with bacteremia or meningitis. Antimicrob Agent Chemother 1998;42:1517–19.[Abstract/Free Full Text]
Pearlman MD, Pierson CL, Faix RG. Frequent resistance of clinical group B streptococci isolates to clindamycin and erythromycin. Obstet Gynecol 1998;92:258–61.[Abstract]
Murdoch DR, Reller LB. Antimicrobial susceptibilities of group B streptococci isolated from patients with invasive disease: 10-year perspective. Antimicrob Agent Chemother 2001;45:3623–4.[Abstract/Free Full Text]
Baker CJ, Kasper DL. Correlation of maternal antibody deficiency with susceptibility to neonatal group B streptococcal infection. N Engl J Med 1976;294:753–6.[Abstract]
Baker CJ, Kasper DL. Group B streptococcal vaccines. Rev Infect Dis 1985;7:458–67.[Medline]
Baker CJ, Rench MA, Edwards MS, et al. Immunization of pregnant women with a polysaccharide vaccine of group B streptococcus. N Engl J Med 1988;319:1180–5.[Abstract]
Zaleznik DF, Rench MA, Hillier S, et al. Invasive disease due to group B streptococcus in pregnant women and neonates from diverse population groups. Clin Infect Dis 1999;30:276–81.
Harrison LH, Elliott JA, Dwyer DM, et al. Serotype distribution of invasive group B streptococcal isolates in Maryland: implications for vaccine formulation. J Infect Dis 1998;177:998–1002.[Medline]
Wessels MR, Paoletti LC, Kasper DL, et al. Immunogenicity in animals of a polysaccharide-protein conjugate vaccine against type III group B streptococcus. J Clin Invest 1990;86:1428–33.
Kasper DL, Paoletti LC, Wessels MR, et al. Immune response to type III group B streptococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. J Clin Invest 1996;98:2308–14.[Medline]
Baker CJ, Paoletti LC, Wessels MR, et al. Safety and immunogenicity of capsular polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccines for group B streptococcal types Ia and Ib. J Infect Dis 1999;179:142–50.[CrossRef][Medline]
Baker CJ, Paoletti LC, Rench MA, et al. Use of capsular polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine for type II group B streptococcus in healthy women. J Infect Dis 2000;182:1129–38.[CrossRef][Medline]
Paoletti LC, Rench MA, Kasper DL, et al. Effects of alum adjuvant or a booster dose on immunogenicity during clinical trials of group B streptococcal type III conjugate vaccines. Infect Immun 2001;69:6696–701.[Abstract/Free Full Text]
Fernandez M, Paoletti LC, Kasper DL, et al. Evaluation of a bivalent group B streptococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine [abstract 33]. Clin Infect Dis 1999;29:966.
Baker CJ, Rench MA, McInnes P. Safety and immunogenicity of group B streptococcal (GBS) type III capsular polysaccharide (CPS)-tetanus toxoid (III-TT) conjugate vaccine in pregnant women [abstract 370]. Clin Infect Dis 2001;33:1151.
Lin F-YC, Philips III JB, Azimi PH, et al. Level of maternal antibody required to protect neonates against early-onset disease caused by group B streptococcus type Ia: a multicenter seroepidemiology study. J Infect Dis 2001;184:1022–8.[CrossRef][Medline]
Baker CJ, Carey VJ, Edwards MS, et al. Quantity of maternal antibody at delivery that protects neonates from early-onset group B streptococcal disease. JAMA, submitted.
Whitman C, Belgharbi L, Gasse F, et al. Progress towards the global elimination of neonatal tetanus. World Health Stat Q 1992;45:248–56.[Medline]
Paradiso PR. Maternal immunization: the influence of liability issues on vaccine development. Vaccine 2002;20:S73–4.[CrossRef]
Schuchat A. Group B streptococcal disease: from trials and tribulations to triumph and trepidation. Clin Infect Dis 2001;33:751–6.[CrossRef][Medline]
Farley MM. Group B streptococcal disease in nonpregnant adults. Clin Infect Dis 2001;33:556–61.[CrossRef][Medline]
Muñoz P, Llancaqueo A, Rodríguez-Créixems M, et al. Group B streptococcus bacteremia in nonpregnant adults. Arch Intern Med 1997;157:213–16.[Abstract]
Henning KJ, Hall EL, Dwyer DM, et al. Invasive group B streptococcal disease in Maryland nursing home residents. J Infect Dis 2001;183:1138–42.[CrossRef][Medline] Группа B стрептококковый сопряженных вакцин
C J Бейкер, М S Эдвардс
Секция инфекционных болезней, кафедра педиатрии, Бейлор медицинский колледж, Хьюстон, Техас 77030, США
Корреспонденция на:
Корреспонденция на:
Д-р М. С. Эдвардс, Бейлор Медицинского колледжа, один Бейлор Plaza, комната 302A, Хьюстон, Техас 77030, США;
morvene@bcm.tmc.edu
Принято к публикации 5 октября 2002 года
АННОТАЦИЯ
Связь бактериальных капсульные полисахариды к белкам для создания вакцины, сопряженных оказал серьезное воздействие на здоровье детей. Хотя unconjugated полисахаридов плохо иммуногенность у детей и детей более старшего возраста и взрослых, их ковалентной связью с белками стимулирует Т-клеток зависит антигенных признание того, что серьезно повышает иммуногенность. За десятилетие с момента внедрения и широкого использования гемофилического гриппа типа B полисахаридной сопряженных вакцин в Соединенных Штатах, инвазивные H гриппа инфекции стали редкостью в childhood.1 также конъюгация полисахаридов из Streptococcus pneumoniae к производной от дифтерии анатоксином и Помимо пневмококковой вакцины сопряженных детской иммунизации графики несет в себе надежду на аналогичное снижение заболеваемости инвазивными пневмококковая болезнь в педиатрических patients.2
-------------------------------------------------- ------------------------------
Ключевые слова: вакцина; стрептококк
Сокращения: CPS, капсульные полисахаридной; GBS, стрептококк группы В; GMC, геометрической средней концентрации; МАГМП, intrapartum профилактику антибиотиками; ТТ, столбнячный анатоксин
Инвазивные болезни, вызванные стрептококк группы В (GBS), остается одной из основных причин смертности и заболеваемости новорожденных и младенцев. Несмотря на внедрение и широкое внедрение материнской intrapartum профилактику антибиотиками (IAP) в США с 1996 года, по оценкам 2200 новорожденных в течение первой недели жизни, и 1400 младенцев 7-89 дней возраста будут развиваться инвазивных GBS болезнь ежегодно; 140 из этих случаев будет fatal.3 матери МАГМП Хотя, безусловно, эффективным и привело к сокращению числа случаев раннего начала болезни почти на 75%, то в лучшем случае временным вмешательства, что не мешает всем раннего начала и не имеет никакого влияния на заболеваемость позднего начала GBS болезни. Например, начиная с 20-25% доставки женщин в США в настоящее время получают МАГМП, развитие резистентности к пенициллину среди GBS изолятах является обеспокоенность тем, что теоретически могло бы сделать это вмешательство неэффективно. Еще недавно, и значительного увеличения сопротивления эритромицин и клиндамицин среди GBS были задокументированы несколько групп investigators.4-6
Цель этого обзора состоит в том, чтобы представить обновленную информацию о состоянии GBS полисахаридной-белок сопряженных вакцин. Обзор представит обоснование для разработки вакцин, сопряженная GBS, нынешний статус клинических испытаний этих вакцин, а также перспективы для будущего использования GBS сопряженные вакцин.
ОБОСНОВАНИЕ GBS полисахаридной-БЕЛКА Conjugate ВАКЦИН
Защитную роль для антител к капсульные полисахаридной (CPS) типа III GBS был предсказан в 1970-е годы на Бейкера и Kasper.7 Эти следователи показали, что младенцы с инвазивными рано или поздно начала GBS болезни были рождены матерями с очень низкого уровня III CPS специфических антител в сыворотке при родах. Вывод о том, что человеческой сыворотки, содержащей достаточно концентрации ХП конкретные IgG способствовала эффективному opsonisation и фагоцитоз в пробирке и при условии защиты от смертоносной инфекции экспериментальных подтвердили важность капсульные серотипа специфических антител. Эта информация, наряду с указанием, что эффективность вакцины против пневмококковой полисахаридной у взрослых, считает, что активной иммунизации беременных женщин с помощью очищенного GBS полисахаридов может защитить новорожденных и младенцев. Посылка заключается в том, что при вакцинации вызвал защитные уровни антител в детородный возраст женщин, плацентарная прохождение этих GBS CPS специфических антител бы защитить новорожденных в течение всего периода болезни риск инвазивного GBS инфекции (например, первые 2-3 месяцев жизни) .
После GBS трех основных серотипов, что причиной заболевания инвазивные GBS (IA, II и III), были структурно и immunochemically определено, было чувство ожидания среди следователей на местах. Первым кандидатом GBS вакцины, чистый тип III CPS, прошел 1 этап тестирования у здоровых взрослых в 1978 году; впоследствии типа Ia и II УК вакцин были изучены. В отличие от отличная иммуногенность наблюдается у взрослых прививки с multivalent пневмококковая полисахаридной вакцины типа Ia, II, III и полисахаридов, в то время как хорошо, был неравномерным иммуногенности. Большинство взрослых (около 90%), было обнаружено, были очень низкими preimmunisation сывороточной концентрации ХП специфических антител. Эти низкие уровни, предположительно, с указанием иммунологические наивность для GBS полисахариды, предсказал бедных иммунный ответ на многие, так что только 40% и 60% соответственно, разработал значительное увеличение специфических антител после иммунизации типа Ia и III полисахариды. Напротив, 88% тех, кто привит типа II УК responded.8 В нескольких взрослых, которые предположительно были "инициированы" на GBS полисахаридов или смежных антигены (обозначается значком умеренно увеличить сывороточной концентрации специфических антител CPS), иммунизация типа Ia, II, III и полисахаридов вызвала оживленный иммунных реакций в почти 100%.
Судебных процессов с GBS полисахаридной вакцины проверены возможности иммунизации в качестве подхода к предупреждению GBS болезнью и выявили необходимость в разработке вакцин-кандидатов с улучшенными immunogencity. Один стимулом для конечного успеха GBS вакцины программа стала первым исследование, проведенное среди беременных женщин. Среди респондентов с типом III GBS CPS вакцины в ведении около 31 недель беременности, 90% имели детей, со значительным уровнем III CPS специфических антител в сыворотке мозга, которые поощряют opsonisation и убийство тип III GBS в пробирке, что функциональная активность младенческой сыворотки сохраняется в большинстве возрасте до 3 месяцев. Таким образом, в концепции, материнской Immunisation с оптимальным GBS иммуногенность вакцины в течение третьего триместра должна защитить новорожденных и младенцев от инвазивных GBS инфекции в эпоху risk.9
Нынешний статус GBS Conjugate ВАКЦИН
В начале 1990-х годов новая GBS серотипа, типа V, возникли среди случаев в США и в других странах. В недавнем multicity Активные эпиднадзору исследование инвазивных GBS заболевания осуществляется в расово и этнически разнообразный контингент беременных и новорожденных, отметили, что тип V составляли 23% и 14% соответственно, материнской и ранней неонатальной начала cases.10 Появление типа V, и все большее число nontypeable GBS изоляты из colonised взрослых подчеркивает важность постоянного эпидемиологического расследования в разработке соответствующих multivalent GBS вакцины. Взятые вместе, типы Ia, III и V GBS в настоящее время составляют не менее 75%, а пять серотипов (Ia, Ib, II, III и V) практически для 100% GBS заболеваний у младенцев и adults.11
Разработка первого GBS сопряженных вакцины, тип III полисахаридной-столбнячного анатоксина, было обусловлено его известность среди младенцев изолирует, особенно с менингитом и поздним началом любой инфекции клинические проявления. Этот тип III CPS был ковалентно связаны с мономерные столбняка анатоксином с использованием редуктивных amination сцепления chemistry.12 Все GBS конъюгатов на сегодняшний день было произведено с этой связью химии, а также с одним исключением, все исследования, на сегодняшний день оценивается в конъюгатов здоровых взрослых людей, используя в качестве столбнячный анатоксин белка перевозчика.
В первой клинической оценке сопряженных GBS, 100 женщин в возрасте 18-40 лет были Рандомизированные для получения любого типа III CPS-столбнячный анатоксин (III-TT) сопряжение вакцин в одной из трех доз, расцепкой III CPS, либо плацебо (соленые) .13 каждой вакцины было хорошо, и преобладает III CPS конкретных антител isotype (> 95%) получили по иммунизации была IgG. Хотя высшее среднее геометрическое CPS IgG конкретные уровни были достигнуты в ответ на высокие дозы от сопряженных более чем в четыре раза повышается были достигнуты в 90% получателей III-TT, но только 50% получателей CPS III (P = 0,0015). III CPS конкретных IgG вызвал к иммунизации является функциональным в пробирке и в охраняемых новорожденных мышей от смертоносного вида III GBS задачей. Таким образом, сопряжение с ТТ значительно расширенной иммуногенность и отметил, что профилактика перинатальной GBS болезней путем иммунизации матери потенциально возможным.
Начиная с 1996 года, сопряженных с вакцинами каждый из клинически значимых GBS серотипы причинение инвазивных заболеваний были разработаны и испытаны в почти 500 здоровых молодых adults.14-17 Каждая из этих вакцин было хорошо, когда с учетом как единый внутримышечная дозу или две дозы . Отсутствие серьезных вакцина связанные события произошли. Большинство получателей были лишь легкой до умеренной болезненность в месте инъекции или нет заметных симптомов или признаков. Системные реакции, состоящей из низкосортных лихорадка, озноб, головная боль, или myalgias чтобы решить в течение 24-36 часов произошло менее чем на 2% из почти 500 добровольцев.
"Доза-реакция" испытание было проведено для Ia, Ib, II, III, V и CPS-TT конъюгатов для определения минимальных доз, которые могут быть использованы в multivalent вакцины (таблица 1). Такие данные необходимы для сведения к минимуму общую сумму полисахарид, необходимых для стимулирования защитных уровень иммунитета и ставки местных реакций, которые, как представляется, в первую очередь зависит от общей дозы столбняка перевозчика. Иммунный ответ на GBS конъюгатов, за исключением типа V, являются дозы зависят. Дозы ~ 4 мкг по типу II CPS, 10 мкг для типа V, и ~ 15 мкг типов Ia, Ib и III CPS вызвали более чем четырехкратное увеличение CPS конкретных IgG в 80-93% добровольцев, восемь недель после Прививки. Для каждого серотипа, конъюгация значительно расширила иммуногенность сравнению с расцепкой полисахаридов. Вакцина ответов в целом достигнет пика в четыре-восемь недель после иммунизации, а затем спад. На один год после иммунизации, геометрической средней концентрации (GMC) антител составляет примерно 50% от пикового уровня. Например, предметы привит с 15 мкг доза типа Ia CPS-TT имеют GMC от 18.3 мкг / мл на восемь недель после иммунизации и 9,1 мкг / мл в одном year.14 основе ограниченных данных на двух лет после иммунизации, GMC по-прежнему значительно выше базового уровня, что, как сопряженная с другими вакцинами, в ответ на GBS сопряженные вакцин прочного (Бейкер и colleagues14, 15; также Бейкер и др., неопубликованные наблюдения).
Просмотр этой таблицы:
[в окне]
[в новом окне]
Таблица 1 Группа B стрептококковый CPS-TT сопряженных вакцин
Функциональная активность была испытана в пробирке с opsonophagocytosis тесте. Для каждого серотипа, положительные корреляции между убийством гомологичная GBS штаммов человеческого нейтрофилов после opsonisation путем дополнения и концентрация сопряженных вакцинального CPS конкретных IgG.13-16 Эти выводы свидетельствуют о том, что GBS конъюгаты дизайн, аналогичные тем, которые уже прошли проверку, будут эффективными GBS в профилактике болезней. Таблица 1 суммирует иммунных ответов на теоретически оптимальную дозировку каждого GBS сопряженных испытания вакцины у здоровых взрослых и доля заболеваний у беременных женщин и младенцев (в начале и в конце начала заболевания) в результате пять серотипов. Масштабы иммунных ответов свидетельствует о том, что одна доза пятивалентной GBS сопряженных вакцина, возможно, предстоит сыграть эффективность около 90%.
Что пятивалентной вакцины в качестве цели, предварительная оценка сочетания типов II-III TT и TT-вакцины было conducted.17 Это двухвалентный II / III CPS-TT сопряженных вакцины было хорошо у здоровых взрослых и иммунной вмешательство не было отмечено По сравнению с вакцинированными, кто получил моновалентной TT-II или III-TT сопряженные. Двухвалентной вакцины стимулирует иммунный ответ, сопоставимые с теми вызвал одним из моновалентной конъюгатов. Другим важным вопросом является ли одна доза вакцины GBS сопряженных будет получить оптимальный ответ среди большинства получателей, или же "бустер" будет необходимо. Для решения этой проблемы группа здоровых взрослых, получили вторую дозу III-TT вакцины 21 месяцев после своего первоначального immunisation.16 Нет увеличением реактогенность был замечен, а в III GMC CPS конкретных IgG восемь недель после второй дозы был аналогичен в том, что заметил, что после первоначальной дозы, что указывает не щейся бустер эффект для группы в целом. Небольшая доля взрослого населения, некоторые из них с наименьшими preimmunisation концентрации антител, сделали выставку "бустер" ответ. Дальнейшие исследования необходимо будет доказать гипотезу о том, что эти люди действительно наивно антиген, были "инициированы" с первой дозы, а затем был оптимальный ответ.
Две партии типа V сопряженных вакцины были испытаны в фазу 1 клинических испытаний (CJ Бейкер, неопубликованные наблюдения). Впервые использован TT и второй мутант токсина дифтерии, кросс реактивных материалов 197 (CRM197). Два конъюгаты были также хорошо. Тип V-TT получателей были немного выше, CPS конкретные уровни IgG в сыворотке после иммунизации, чем V-CRM197 группе, но различия не были значительными. Эти выводы, используя CRM197 как белка перевозчика, являются важными, поскольку они подтверждают, что более чем на один перевозчик может нанять Т-клеток помощь, необходимую для адекватного иммунного ответа на GBS полисахарида.
Как и в случае с расцепкой GBS полисахарид, 1 этап судебного разбирательства у женщин на 32-34 неделе беременности был только что completed.18 После randomisation, III-TT сопряженных (12.5 мкг доза III CPS) или соленых плацебо под управлением 20 и 10 женщин, соответственно. III CPS конкретной концентрации IgG определяли в сыворотке матери при родах (в среднем 8,3 недель после иммунизации), младенческой шнур сывороток и сывороток получить младенцев на 1 и 2-месячного возраста. GMCS на поставку сыворотки от прививки женщин было значительно увеличено с preimmunisation ценности и хорошо коррелировала (р = 0.93), с младенческого мозга ценностей. Фактическое GMCS в сывороток от вакцинированных детей, женщин было 3,7 и 2,2 мкг / мл, соответственно, на 1 и 2-месячного возраста. Сера из этих детей, вакцинированных женщин одинаково способствовали opsonisation типа III GBS и убийств нейтрофилов в пробирке. Таким образом, сопряженных вакцинального III CPS конкретных IgG было эффективно транспортироваться на новорожденных и функции также в пробирке, что multivalent GBS сопряженных вакцина обладает потенциалом для предотвращения конца, а также раннего начала GBS детская болезнь, и, возможно, в силу сокращение уровня материнской инвазивных заболеваний также.
БАРЬЕРЫ НА лицензирования GBS Conjugate ВАКЦИН
Более двух десятилетий исследование подтверждает идею о том, что иммунизация матерей с multivalent GBS сопряженных вакцины является действенным подходом к профилактике заболеваний GBS в зачаточном состоянии. Опубликованные данные свидетельствуют о том, что кандидат GBS полисахаридной-столбнячный анатоксин конъюгатов безопасны у взрослых и получения антител гораздо выше того, что, скорее всего, будет пассивно защитные для новорожденных и молодых infants.19, 20 оставшихся научных вопросов, которые необходимо ответить для лицензирования является документирование Эффективность GBS сопряженных вакцины в 3 этапа судебного разбирательства. В целях облегчения такого судебного процесса, формирование корпоративного партнерства с фармацевтической компанией, было бы желательным. Существуют опасения в отношении таких обязательств. Одним из очевидных дорожное является давним нерешительность противостоять ответственности вопросов, которые окружают иммунизации беременных женщин. Тем не менее, миллионы доз столбнячного анатоксина были беременные женщины, не имеющие негативного effects.21 С GBS полисахариды являются простыми сахарами, то трудно представить себе что они, помимо благотворного воздействия на беременных женщин и их плодов при ведении в начале третьего триместра. Было высказано мнение, что компенсация вреда программы, аналогичные тем, которые действуют в детстве прививки, должны быть разработаны для иммунизации матери программ по созданию благоприятных условий для провайдеров и призывая к вакцине industry.22 образование, в 1990-х годов, таких Информационно-пропагандистская деятельность групп, как Группа B Strep ассоциации в Соединенных Штатах Америки и канадской группы B Strep ассоциация в Канаде способствовали средства массовой информации внимание на важность принятия вакцины предотвращения GBS инфекции reality.23 Хотя другие целевые группы населения, такие, как nonpregnant, фертильном возраст женщины и даже подростки, могут быть рассмотрены по иммунизации, эффективности тестирования не будет носить практический характер в таких групп населения. Вместе с тем, nonpregnant взрослые с определенными медицинскими показаниями, таких, как сахарный диабет, хронические заболевания печени и злокачественных, или тех, более чем 65-летнего возраста, будет разумным целевых групп населения с учетом их нынешнего инвазивных GBS болезни burden.24-26 На сегодняшний день практически нет информации Имеющиеся в отношении потенциально CPS защитных специфических антител в эти пациенты, независимо от того, другие иммунную защиту аномалии делают защитные уровни функционально недостаточным, и если GBS сопряженных адекватно иммуногенность. Научные доказательства материнской Прививки для предотвращения перинатальной GBS болезнь убедительной. Если перинатальной GBS болезни заключается в том, чтобы стать, как и в H гриппа типа B заболеваний у детей, редко, времени для фармацевтической промышленности в настоящее время руководство.
ОТЗЫВЫ
Центры по контролю и профилактике заболеваний. Прогресс в направлении ликвидации Hemophilus гриппа типа B болезнью среди грудных детей и детей-Соединенные Штаты Америки, 1987-1997 годы. Morbid Mortal Еженедельник Rep 1998; 47:993-8. [Medline]
Obaro S, Adegbola Р. пневмококк: перевозки, болезней и сопряженного вакцин. J Med Microbiol 2002; 51:98-104. [Аннотация / Свободный Полный текст]
Schrag SJ, Zywicki S, Фарли М., и др.. Группа B стрептококковой инфекции в эру intrapartum профилактику антибиотиками. N Engl J Med 2000; 342:15-20. [Аннотация / Свободный Полный текст]
Фернандес М, Hickman ME, Бейкер CJ. Противомикробные восприимчивостей группы B стрептококки изолированных между 1992 и 1996 годах у пациентов с бактериемией или менингит. Antimicrob Агент Chemother 1998; 42:1517-19. [Аннотация / Свободный Полный текст]
Pearlman MD, Пирсон CL, Faix RG. Частые сопротивление клинической группе B стрептококки изолятов на клиндамицин и эритромицин. Obstet Gynecol 1998; 92:258-61. [Аннотация]
Д. Р. Мердок, Reller LB. Противомикробные восприимчивостей группы B стрептококки изолированных от пациентов с инвазивным болезни: 10-летнюю перспективу. Antimicrob Агент Chemother 2001; 45:3623-4. [Аннотация / Свободный Полный текст]
Бейкер CJ, Каспер DL. Соотношение дефицита антител матери с новорожденным восприимчивость к группе B стрептококковой инфекцией. N Engl J Med 1976; 294:753-6. [Аннотация]
Бейкер CJ, Каспер DL. Группа B стрептококковый вакцин. Rev Infect Дисе 1985; 7:458-67. [Medline]
Бейкер CJ, RENCH М.А., Эдвардс М.С., и др.. Иммунизация беременных женщин с полисахаридной вакцины от группы B стрептококк. N Engl J Med 1988; 319:1180-5. [Аннотация]
Zaleznik DF, RENCH М.А., Хиллиер S, и др.. Инвазивные болезни вследствие стрептококк группы В у беременных женщин и новорожденных из различных групп населения. Clin Infect Дисе 1999; 30:276-81.
Харрисон LH, Elliott JA, Дуайер Д.М., и др.. Серотип распространения инвазивных группы B стрептококковый изолятах в Мэриленд: последствия для разработки вакцины. J Infect Дисе 1998; 177:998-1002. [Medline]
Wessels М.Р., Paoletti LC, Каспер DL, и др.. Иммуногенности в животных полисахарид-белок сопряженных вакцина против типа III группы B стрептококк. J Clin Инвест 1990; 86:1428-33.
Каспер DL, Paoletti LC, Wessels М.Р., и др.. Иммунный ответ на тип III группы B стрептококковый полисахаридной-столбнячный анатоксин сопряженных вакцины. J Clin Инвест 1996; 98:2308-14. [Medline]
Бейкер CJ, Paoletti LC, Wessels М.Р., и др.. Безопасности и иммуногенности капсульные полисахаридной-столбнячный анатоксин сопряженных вакцин для группы B стрептококковый типов Ia и Ib. J Infect Дисе 1999; 179:142-50. [CrossRef] [Medline]
Бейкер CJ, Paoletti LC, RENCH М.А., и др.. Использование капсульные полисахаридной-столбнячный анатоксин сопряженных вакцина для типа II группы B стрептококк у здоровых женщин. J Infect Дисе 2000; 182:1129-38. [CrossRef] [Medline]
Paoletti LC, RENCH М.А., Каспер DL, и др.. Действие квасцов адъювант или бустерные дозы на иммуногенность во время клинических испытаний в группе B стрептококковый тип III сопряженных вакцин. Infect иммунизации 2001; 69:6696-701. [Аннотация / Свободный Полный текст]
Фернандес М, Paoletti LC, Каспер DL, и др.. Оценка двухвалентный группу B стрептококковый полисахаридной-столбнячный анатоксин сопряженных вакцины [аннотация 33]. Clin Infect Дисе 1999; 29:966.
Бейкер CJ, RENCH М.А., Макиннес П. безопасности и иммуногенности стрептококками группы В (GBS) тип III капсульные полисахаридной (CPS)-столбнячный анатоксин (III-TT) сопряжение вакцины у беременных женщин [аннотация 370]. Clin Infect Дисе 2001; 33:1151.
Линь F-YC, Philips III JB, Азими PH, и др.. Уровень материнской антител, необходимых для защиты новорожденных от раннего начала болезни, вызванные группы B стрептококк типа Ia: многоцентровыми seroepidemiology исследования. J Infect Дисе 2001; 184:1022-8. [CrossRef] [Medline]
Бейкер CJ, Carey VJ, Эдвардс М.С., и др.. Количество антител матери при родах, который защищает новорожденных от раннего начала группы B стрептококкового заболевания. JAMA, который был представлен.
Уитман C, L Belgharbi, Gasse F, и др.. Прогресс в достижении глобальной ликвидации столбняка у новорожденных. Мир Здоровье Стат Q 1992; 45:248-56. [Medline]
Paradiso PR. Материнская вакцинации: влияние ответственности вопросам разработки вакцины. Вакцина 2002, 20: S73-4. [CrossRef]
Schuchat A. Группа B стрептококковый болезней: от испытаний и невзгод с триумфом и трепетом. Clin Infect Дисе 2001; 33:751-6. [CrossRef] [Medline]
Фарли ММ. Группа B стрептококкового заболевания в nonpregnant взрослых. Clin Infect Дисе 2001; 33:556-61. [CrossRef] [Medline]
Муньоса P, Llancaqueo, Родригес-Créixems М, и др.. Группа B стрептококк бактериемия в nonpregnant взрослых. Arch Стажер Med 1997; 157:213-16. [Аннотация]
Хеннинг KJ, зал Е.Л., Дуайер Д.М., и др.. Инвазивные группы B стрептококкового заболевания в Мэриленде доме престарелых жителей. J Infect Дисе 2001; 183:1138-42. [CrossRef] [Medline]
английский > русский поменятьПеревести
Potential vaccine for flesh eating bacteria Потенциальная вакцина для плоти бактерий
By Roger Highfield, Science Editor Роджер Highfield, научный редактор
Last Updated: 6:58PM GMT 06 Mar 2008 Последнее обновление: 6:58 PM GMT 06 марта 2008
A new kind of vaccine to protect against the bacteria that cause Strep infections, which afflict more than 600 million people each year and kill 400,000, could be available within five years in the wake of an advance reported today. Новый вид вакцины для защиты от бактерий, которые вызывают Strep инфекции, от которых страдают более 600 миллионов человек каждый год, и убить 400000, может быть доступна в течение пяти лет в результате заранее сообщили сегодня.
Vaccine to fight hidden killer of babies Вакцин для борьбы с скрытый убийца младенцев
An American team has used X rays to take a snapshot of the atomic structure of the streptococcal "M protein," which is critical to the virulence of Group A Streptococcus, the bacterium that cause a wide variety of human diseases including strep throat, rheumatic fever, the life-threatening "flesh-eating" syndrome necrotising fasciitis and infections that kill or damage the unborn child. Американская команда использовала Х-лучей принять снимок атомной структуры стрептококковый "М белка", которая имеет решающее значение для вирулентности группы Streptococcus, бактерии, которые вызывают широкий спектр человеческих болезней, в том числе strep горла, ревматической атаки , угрожающих жизни "плотью поедающей" синдрома necrotising фасцит и инфекций, которые убивают или наносят ущерб еще не родившегося ребенка.
The bacterium is becoming increasingly resistant to antibiotics. Бактерии становятся все более устойчивыми к антибиотикам. However, the University of California, San Diego-led research team has demonstrated that immunisation with a stabilised version of the M1 protein can potentially offer protection, as studies how it stimulates the immune system in mice, without the serious side effects caused by natural M1 protein. Однако, Калифорнийский университет, Сан-Диего под руководством исследовательской группы показал, что иммунизация с стабилизированной версии M1 протеин может предложить защиту, как исследования, каким он стимулирует иммунную систему мышей, без серьезных побочных эффектов, вызванных стихийными M1 белка.
They say that their results should help scientists develop protein-based vaccines. Они говорят, что их результаты должны помочь ученым разработать белковой основе вакцины.
"We created a modified version of M1 with a more stable structure, and found that it is just as effective at eliciting an immune reaction, but safer than the original version of M1, which has serious drawbacks to its use in a vaccine" says Prof Partho Ghosh, who reports the work in the journal Science. "Мы создали модифицированную версию M1 с более стабильной структурой, и обнаружили, что она столь же эффективна в получении иммунную реакцию, но безопаснее, чем оригинальная версия М1, которая имеет серьезные недостатки в его использовании в вакцине говорит профессор Partho Гош, который сообщает о работе в журнале "Наука.
The natural version causes havoc. Природный версия причины разрушения. "Certain antibodies that are produced by the immune system against M1 protein have been shown to cross-react with normal human tissues including heart muscle, potentially triggering the serious autoimmune disease known as rheumatic fever," adds coauthor Prof Victor Nizet. "Определенные антитела, которые производятся иммунной системой против M1 белком, были показаны по кросс-реакцию с нормальной человеческой ткани, включая мышцы сердца, возможно, вызывает серьезные аутоиммунные заболевания известного как ревматической атаки", добавляет соавтор профессор Виктор Nizet.
"M1 protein can also act as a toxin, producing clotting abnormalities and lung injury when injected into mice." "M1 белок может также выступать в качестве токсина, свертывание производства и аномалии легкого вреда при инъекции в мышей".
Streptococci come in many varieties, so a vaccine would need to take at least some account of this diversity, and that different types of streptococci are prevalent in different parts of the world, requiring several kinds of stabilised M1. Стрептококки прийти во многих разновидностей, так что вакцина будет необходимо принимать по крайней мере, некоторые счет этого разнообразия, и что различные виды стрептококки распространены в различных частях мира, что требует нескольких видов стабилизированную M1.
'This represents a major step forward towards producing safer vaccines," comments Prof Howard Jenkinson, University of Bristol. Это представляет собой важный шаг вперед к производству более безопасных вакцин, "Комментарии" Проф Говард Jenkinson Университета Бристоля.
"With recent advances in vaccine development for pneumococci, group B streptococci and staphylococci, it seems possible that a group A vaccine could be available for target groups in about 5 years.' "В последнее время прогресс в области разработки вакцин для pneumococci, стрептококки группы B и staphylococci, кажется возможным, что группа вакцина может быть доступна для целевой группы, примерно в 5 лет".
'A main vaccine target group would probably be young children in populations where strep throat or skin infections are particularly prevalent. 'Основной целевой группой вакцина, возможно, будет малолетних детей в группах населения, где strep горло или кожные инфекции особенно распространены.
"An oral (by mouth) vaccine is most desirable. However, the serious scenario of strep infections is that they can result in longer-term damage to tissues and organs. So before such a vaccine is available for humans, any possibility for longer-term damage must be identified and eliminated.' "Устный (ртом) Вакцина является наиболее желательным. Тем не менее, серьезные сценарии strep инфекций заключается в том, что они могут привести к долгосрочным повреждение тканей и органов. Поэтому, прежде чем такая вакцина доступна для людей, какие-либо возможности для долгосрочного Термин ущерб должны быть выявлены и устранены ".
Prof Jenkinson has been awarded a grant of £285,000 from The Wellcome Trust to research ways to combat diseases caused by Streptococcus bacteria. Проф Jenkinson был присужден грант в размере £ 285000 от Велком Траст исследований способов борьбы с заболеваниями, вызываемыми бактериями Streptococcus.
Familiar to those who suffer from 'strep' throat, Streptococcus are the most common bacteria in the human mouth and throat. Знакомый с тем, кто страдает от "strep 'горло, Streptococcus являются самым распространенным бактерий в человеческом рта и горла. They are linked to a number of health problems, some mild, some life-threatening, ranging from tooth and gum disease to meningitis, pneumonia, and endocarditis. Они связаны с рядом проблем со здоровьем, некоторые мягкие, некоторые опасные для жизни, начиная от зубов и заболеваний десен до менингита, пневмонии и эндокардит.
Streptococcus are potent bacteria which are becoming increasingly resistant to treatment by antibiotics. Streptococcus являются мощным бактерии, которые становятся все более устойчивы к лечению антибиотиками. The rate of severe invasive Streptococcus infections is about 60 per 100,000. Ставка тяжелой инвазивных Streptococcus инфекций составляет около 60 на 100000.
Prof Jenkinson said: 'Streptococcus bacteria are amongst the most commonly encountered in infections, and for the most part we depend totally on antibiotics to fight them. Проф Jenkinson сказал: "Streptococcus бактерии относятся к числу наиболее часто возникающих в инфекциями, а по большей части мы зависим полностью на антибиотики для борьбы с ними. Our research will help develop new infection-control methods that do not rely on conventional antibiotics, and will also help identify people who are at higher risk of infections.' Наши исследования помогут разработать новые инфекции методы контроля, которые не полагаются на традиционные антибиотики, а также будет способствовать выявлению людей, которые подвергаются высокому риску заражения ".
The study involves Drs Michele Barbour, Linda Franklin and Sarah Maddocks, also from the Department of Oral & Dental Science; Dr Aras Kadioglu, University of Leicester and Dr Nicklas Strömberg, Umeå University. Исследование предполагает д-Микеле Барбура, Линда Франклин и Сара Maddocks, а также из Департамента Устные И стоматологической науки; р Араса Кадиоглу, Лестерский университет, и д-р Nicklas Стромберг, университет Умео.
By Roger Highfield, Science Editor Роджер Highfield, научный редактор
Last Updated: 6:58PM GMT 06 Mar 2008 Последнее обновление: 6:58 PM GMT 06 марта 2008
A new kind of vaccine to protect against the bacteria that cause Strep infections, which afflict more than 600 million people each year and kill 400,000, could be available within five years in the wake of an advance reported today. Новый вид вакцины для защиты от бактерий, которые вызывают Strep инфекции, от которых страдают более 600 миллионов человек каждый год, и убить 400000, может быть доступна в течение пяти лет в результате заранее сообщили сегодня.
Vaccine to fight hidden killer of babies Вакцин для борьбы с скрытый убийца младенцев
An American team has used X rays to take a snapshot of the atomic structure of the streptococcal "M protein," which is critical to the virulence of Group A Streptococcus, the bacterium that cause a wide variety of human diseases including strep throat, rheumatic fever, the life-threatening "flesh-eating" syndrome necrotising fasciitis and infections that kill or damage the unborn child. Американская команда использовала Х-лучей принять снимок атомной структуры стрептококковый "М белка", которая имеет решающее значение для вирулентности группы Streptococcus, бактерии, которые вызывают широкий спектр человеческих болезней, в том числе strep горла, ревматической атаки , угрожающих жизни "плотью поедающей" синдрома necrotising фасцит и инфекций, которые убивают или наносят ущерб еще не родившегося ребенка.
The bacterium is becoming increasingly resistant to antibiotics. Бактерии становятся все более устойчивыми к антибиотикам. However, the University of California, San Diego-led research team has demonstrated that immunisation with a stabilised version of the M1 protein can potentially offer protection, as studies how it stimulates the immune system in mice, without the serious side effects caused by natural M1 protein. Однако, Калифорнийский университет, Сан-Диего под руководством исследовательской группы показал, что иммунизация с стабилизированной версии M1 протеин может предложить защиту, как исследования, каким он стимулирует иммунную систему мышей, без серьезных побочных эффектов, вызванных стихийными M1 белка.
They say that their results should help scientists develop protein-based vaccines. Они говорят, что их результаты должны помочь ученым разработать белковой основе вакцины.
"We created a modified version of M1 with a more stable structure, and found that it is just as effective at eliciting an immune reaction, but safer than the original version of M1, which has serious drawbacks to its use in a vaccine" says Prof Partho Ghosh, who reports the work in the journal Science. "Мы создали модифицированную версию M1 с более стабильной структурой, и обнаружили, что она столь же эффективна в получении иммунную реакцию, но безопаснее, чем оригинальная версия М1, которая имеет серьезные недостатки в его использовании в вакцине говорит профессор Partho Гош, который сообщает о работе в журнале "Наука.
The natural version causes havoc. Природный версия причины разрушения. "Certain antibodies that are produced by the immune system against M1 protein have been shown to cross-react with normal human tissues including heart muscle, potentially triggering the serious autoimmune disease known as rheumatic fever," adds coauthor Prof Victor Nizet. "Определенные антитела, которые производятся иммунной системой против M1 белком, были показаны по кросс-реакцию с нормальной человеческой ткани, включая мышцы сердца, возможно, вызывает серьезные аутоиммунные заболевания известного как ревматической атаки", добавляет соавтор профессор Виктор Nizet.
"M1 protein can also act as a toxin, producing clotting abnormalities and lung injury when injected into mice." "M1 белок может также выступать в качестве токсина, свертывание производства и аномалии легкого вреда при инъекции в мышей".
Streptococci come in many varieties, so a vaccine would need to take at least some account of this diversity, and that different types of streptococci are prevalent in different parts of the world, requiring several kinds of stabilised M1. Стрептококки прийти во многих разновидностей, так что вакцина будет необходимо принимать по крайней мере, некоторые счет этого разнообразия, и что различные виды стрептококки распространены в различных частях мира, что требует нескольких видов стабилизированную M1.
'This represents a major step forward towards producing safer vaccines," comments Prof Howard Jenkinson, University of Bristol. Это представляет собой важный шаг вперед к производству более безопасных вакцин, "Комментарии" Проф Говард Jenkinson Университета Бристоля.
"With recent advances in vaccine development for pneumococci, group B streptococci and staphylococci, it seems possible that a group A vaccine could be available for target groups in about 5 years.' "В последнее время прогресс в области разработки вакцин для pneumococci, стрептококки группы B и staphylococci, кажется возможным, что группа вакцина может быть доступна для целевой группы, примерно в 5 лет".
'A main vaccine target group would probably be young children in populations where strep throat or skin infections are particularly prevalent. 'Основной целевой группой вакцина, возможно, будет малолетних детей в группах населения, где strep горло или кожные инфекции особенно распространены.
"An oral (by mouth) vaccine is most desirable. However, the serious scenario of strep infections is that they can result in longer-term damage to tissues and organs. So before such a vaccine is available for humans, any possibility for longer-term damage must be identified and eliminated.' "Устный (ртом) Вакцина является наиболее желательным. Тем не менее, серьезные сценарии strep инфекций заключается в том, что они могут привести к долгосрочным повреждение тканей и органов. Поэтому, прежде чем такая вакцина доступна для людей, какие-либо возможности для долгосрочного Термин ущерб должны быть выявлены и устранены ".
Prof Jenkinson has been awarded a grant of £285,000 from The Wellcome Trust to research ways to combat diseases caused by Streptococcus bacteria. Проф Jenkinson был присужден грант в размере £ 285000 от Велком Траст исследований способов борьбы с заболеваниями, вызываемыми бактериями Streptococcus.
Familiar to those who suffer from 'strep' throat, Streptococcus are the most common bacteria in the human mouth and throat. Знакомый с тем, кто страдает от "strep 'горло, Streptococcus являются самым распространенным бактерий в человеческом рта и горла. They are linked to a number of health problems, some mild, some life-threatening, ranging from tooth and gum disease to meningitis, pneumonia, and endocarditis. Они связаны с рядом проблем со здоровьем, некоторые мягкие, некоторые опасные для жизни, начиная от зубов и заболеваний десен до менингита, пневмонии и эндокардит.
Streptococcus are potent bacteria which are becoming increasingly resistant to treatment by antibiotics. Streptococcus являются мощным бактерии, которые становятся все более устойчивы к лечению антибиотиками. The rate of severe invasive Streptococcus infections is about 60 per 100,000. Ставка тяжелой инвазивных Streptococcus инфекций составляет около 60 на 100000.
Prof Jenkinson said: 'Streptococcus bacteria are amongst the most commonly encountered in infections, and for the most part we depend totally on antibiotics to fight them. Проф Jenkinson сказал: "Streptococcus бактерии относятся к числу наиболее часто возникающих в инфекциями, а по большей части мы зависим полностью на антибиотики для борьбы с ними. Our research will help develop new infection-control methods that do not rely on conventional antibiotics, and will also help identify people who are at higher risk of infections.' Наши исследования помогут разработать новые инфекции методы контроля, которые не полагаются на традиционные антибиотики, а также будет способствовать выявлению людей, которые подвергаются высокому риску заражения ".
The study involves Drs Michele Barbour, Linda Franklin and Sarah Maddocks, also from the Department of Oral & Dental Science; Dr Aras Kadioglu, University of Leicester and Dr Nicklas Strömberg, Umeå University. Исследование предполагает д-Микеле Барбура, Линда Франклин и Сара Maddocks, а также из Департамента Устные И стоматологической науки; р Араса Кадиоглу, Лестерский университет, и д-р Nicklas Стромберг, университет Умео.
Article Статья
Nature Biotechnology 24 , 191 - 197 (2006) Природа Биотехнология 24, 191 - 197 (2006)
Published online: 15 January 2006; | doi:10.1038/nbt1179 Опубликовано на сайте: 15 января 2006 года; | DOI: 10.1038/nbt1179
Characterization and identification of vaccine candidate proteins through analysis of the group A Streptococcus surface proteome Характеристика и определение вакцин кандидат белков на основе анализа группы Streptococcus поверхность ПРОТЕОМА
Manuel J Rodríguez-Ortega, Nathalie Norais, Giuliano Bensi, Sabrina Liberatori, Sabrina Capo, Marirosa Mora, Maria Scarselli, Francesco Doro, Germano Ferrari, Ignazio Garaguso, Tiziana Maggi, Anita Neumann, Alessia Covre, John L Telford & Guido Grandi Мануэля Родригеса J-Ортега, Натали Norais, Джулиано Bensi, Сабрина Liberatori, Сабрина Капо, Marirosa Мора, Мария Scarselli Франческо Доро, Germano Ferrari, Ignazio Garaguso, Тициана Maggi, Анита Неймана, Alessia Covre, Джон L Telford И Гвидо Grandi
Chiron Vaccines, Via Fiorentina, 1 53100 Siena, Italy. Хирон Вакцины, Виа Фиорентина, 1 53100 Сиена, Италия.
Correspondence should be addressed to Guido Grandi guido_grandi@chiron.com Корреспонденция должна быть адресованы Гвидо Grandi guido_grandi@chiron.com
We describe a proteomic approach for identifying bacterial surface-exposed proteins quickly and reliably for their use as vaccine candidates. Мы описываем протеомических подхода для выявления бактериальной поверхности подвергаются белки быстро и надежно для использования их в качестве вакцин. Whole cells are treated with proteases to selectively digest protruding proteins that are subsequently identified by mass spectrometry analysis of the released peptides. Всего клетки обрабатываются протеаз избирательно дайджест оттопыренными протеины, которые впоследствии определили масс-спектрометрии анализа пептидов освободили. When applied to the sequenced M1_SF370 group A Streptococcus strain, 68 PSORT-predicted surface-associated proteins were identified, including most of the protective antigens described in the literature. При применении к секвенированы M1_SF370 группы Streptococcus штамма, 68-PSORT предсказал поверхностных белков, связанных были выявлены, в том числе большинство защитных антигенов, описанных в литературе. The number of surface-exposed proteins varied from strain to strain, most likely as a consequence of different capsule content. Число поверхностных белков подвергаются разнообразным из штамма напрягаться, скорее всего, как следствие различных капсула содержание. The surface-exposed proteins of the highly virulent M23_DSM2071 strain included 17 proteins, 15 in common with M1_SF370. Поверхности подвергаются белки M23_DSM2071 высокой вирулентного штамма включала 17 белков, 15 совместно с M1_SF370. When 14 of the 17 proteins were expressed in E. Когда 14 из 17 белков, были высказаны в E. coli and tested in the mouse for their capacity to confer protection against a lethal dose of M23_DSM2071, one new protective antigen (Spy0416) was identified. коли и испытанные в мышь для их способность предоставлять защиту от смертоносных доз M23_DSM2071, один новый защитный антиген (Spy0416) были выявлены. This strategy overcomes the difficulties so far encountered in surface protein characterization and has great potential in vaccine discovery. Эта стратегия преодолевает трудности, до сих пор возникают в поверхностных протеинов квалификация и имеет огромный потенциал в вакцине открытий.
Bacterial surface proteins play a fundamental role in the interaction between the bacterial cell and its environment 1, 2, 3, 4, 5, 6 . Бактериальные поверхностные белки играют важную роль во взаимодействии между бактериальных клеток и окружающей среды 1, 2, 3, 4, 5, 6. They are involved in adhesion to and invasion of host cells, in sensing the chemical and physical conditions of the external milieu and sending appropriate signals to the cytoplasmic compartment, in mounting defenses against host responses and in toxicity. Они участвуют в адгезии и инвазии принимающих клеток, в зондирования химические и физические условия внешней среды и передача соответствующих сигналов к цитоплазматической отсека, в оборону против монтажа принимающей ответы и токсичности. Hence, surface proteins are potential targets of drugs aimed at preventing bacterial infections and diseases 7 . Таким образом, поверхностные белки являются потенциальными объектами препаратов, направленных на предупреждение бактериальных инфекций и заболеваний 7. Moreover, because surface proteins are likely to interact with the host immune system, they may become components of effective vaccines. Кроме того, поскольку поверхностные белки могут взаимодействовать с иммунной системой, они могут стать компонентами эффективных вакцин. Vaccines based on surface-exposed and secreted proteins are already commercially available and others are in development 8, 9 . Вакцины основывается на поверхности и подвергается секретированный белков уже коммерчески доступна, а другие находятся в процессе развития 8, 9.
Despite the biological relevance of bacterial surface proteins, their characterization is still incomplete. Несмотря на актуальность биологических бактериальных поверхностных белков, их характеристика по-прежнему неполными. This is mostly owing to difficulties in defining the protein composition and topology on the bacterial surface. Это в основном из-за трудностей в определении состава белка и топология на бактериальные поверхности. There are three main methods currently in practice to identify surface proteins. Существуют три основных метода в настоящее время на практике для выявления поверхностных белков. The first method is based on surface protein prediction by genome analysis using algorithms such as PSORT 10, 11 . Первый метод основан на поверхности белка прогнозирования путем анализа генома с помощью алгоритмов, таких, как PSORT 10, 11. The method is rapid but is not fully reliable and is not quantitative. Этот метод является быстрым, но не является полностью надежным, и не количественный характер. The second approach employs separation of membrane and cell wall fractions from the cytoplasmic fraction and then identification of proteins by two-dimensional (2D)-electrophoresis or 2D-chromatography coupled to mass spectrometry. Второй подход используется разделение мембраны и клеточной стенки от фракции цитоплазматической фракцию, а затем идентификации белков в двумерном (2D)-электрофорез или 2D-хроматографии в сочетании с масс-спектрометрии. This approach, which has been used in several bacteria 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , is reasonably quantitative. Этот подход, который был использован в некоторых бактерий, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, разумно количественный характер. However, it is not sufficiently selective and several cytoplasmic proteins contaminate the identified membrane proteins. Тем не менее, оно не является достаточно избирательно и несколько цитоплазматических белков контаминировать выявленных мембранных белков. Furthermore, neither of these first two approaches specifically identifies those proteins that actually extend beyond the cell wall and polysaccharide capsule into the extracellular milieu. Кроме того, ни один из этих двух подходов, конкретно определяются те белки, которые фактически выходят за пределы клеточной стенки и капсулы в полисахаридной внеклеточной среде. Finally, in the third approach, membrane proteins are first defined using one of the two methods described above and then surface localization is confirmed by producing polyclonal antibodies against the recombinant forms of each predicted protein and by assaying antibody binding to whole bacterial cells. Наконец, в третьем подходе, мембранные белки сначала определить с помощью одного из двух методов, описанных выше, а затем поверхность локализации подтверждается производству поликлональных антител против рекомбинантных форм каждого предсказал белка, а также анализ на антитела к обязательным всего бактериальных клеток. Although this method, recently used to identify vaccine candidates for group B Streptococcus 9 , is quantitative and does identify truly surface accessible proteins, it is extremely labor intensive. Хотя этот метод, в последнее время используется для идентификации вакцин для группы B Streptococcus 9, количественные и делает выявить действительно доступной поверхности белков, крайне трудоемким. Here we describe a new procedure that allows the rapid and selective identification of bacterial surface-exposed proteins, the pool of proteins which are entirely or partially exposed on the outside of bacterial cells. Здесь мы рассмотрим новую процедуру, которая позволяет быстро и селективного выявления бактериальной поверхности подвергаются белки, бассейн белков, которые полностью или частично выставлена на внешней поверхности бактериальной клетки. The method uses proteolytic enzymes to 'shave' the bacterial surface and the peptides generated are separated from the whole cells and identified by mass spectrometry. Этот метод использует протеолитических ферментов в 'брить' бактериальной поверхности и пептидов порожденных отделены от всего клеток и определили масс-спектрометрии. To demonstrate the power of the method, we present the characterization of the complete set of M1_SF370 group A Streptococcus (GAS) surface-exposed proteins. Для того, чтобы продемонстрировать силу этого метода, мы представляем характеризация комплект M1_SF370 группы Streptococcus (газа) на поверхности подвергаются белки. We show that 95% of the identified proteins belong to four protein families of predicted surface-associated proteins, most of which are accessible to polyclonal antibodies raised against the corresponding recombinant proteins. Мы показываем, что 95% из выявленных белков принадлежат четыре белковых семейств предсказал поверхности, связанных с белками, большинство из которых доступны поднятых поликлональных антител против рекомбинантных белков соответствует. We also show that the proteins identified include most of the protective antigens described in the literature and at least one new antigen capable of conferring consistent protection in the mouse against challenge with a virulent GAS strain. Мы также показали, что белки относятся большинство защитных антигенов, описанных в литературе, и по меньшей мере один новый антиген, способных присвоении последовательной защиты в борьбе с проблемой мышь с ГАЗ вирулентного штамма. Therefore, the approach represents a valuable tool to study surface protein organization and to identify new vaccine candidates. Таким образом, этот подход представляет собой ценный инструмент для изучения поверхности белка организации и в целях выявления новых вакцин-кандидатов.
Results Результаты
Analysis of M1_SF370 GAS strain Анализ M1_SF370 ГАЗ штамм
To identify the surface-exposed proteins of the completely sequenced M1_SF370 strain 19 , exponentially growing bacteria were collected and treated with either trypsin or proteinase K to shave the bacterial surface of exposed protein domains. Для выявления поверхностных подвергаются белки полностью секвенированы M1_SF370 штамма 19, экспоненциально растущей бактерии были собраны и лечение либо трипсин или протеиназы К бриться бактериальной поверхности облучаемой белка доменов. This treatment did not impair cell integrity as assessed by plating the bacteria before and after protease digestion (data not shown). Это лечение не нанести ущерб целостности клеток по оценке обшивки бактерий до и после протеазы пищеварения (данные не показаны). Peptides released into the supernatant were concentrated and analyzed by tandem mass spectrometry (MS/MS). Пептиды выпущено в супернатанта были сосредоточены и проанализированы тандем масс-спектрометрия (MS / MS). A total of 72 proteins were identified ( Fig. 1 and Supplementary Table 1 online): 37 from the matching of more than one peptide per protein, and 35 from single-peptide matching. В общей сложности из 72 протеинов было выявлено (рис. 1 и таблица 1 Дополнительная онлайн): 37 из сопоставления нескольких пептидных на белок, и 35 из одного пептида соответствия. Forty-three proteins were deduced from the trypsin-derived peptides, 18 proteins from the proteinase K–derived peptides and 11 proteins from both trypsin and proteinase K–derived peptides. Сорок три белки были выведены из-трипсин полученных пептидов, белков, 18 из протеиназы К-полученных пептидов и белков, 11 из трипсин и протеиназы К-полученных пептидов. From sequence analysis, the 72 proteins could be grouped into four major families: the cell wall–anchored family containing LPXTG-like motifs (12 proteins), the lipoprotein family (11 proteins), the transmembrane protein family (37 proteins) and the secreted-protein family (8 proteins). Из анализа последовательности, 72 белков могут быть сгруппированы в четыре основных семей: клеточной стенки-закрепленные семье, содержащей LPXTG-подобные мотивы (12 белков), липопротеина семьи (11 белков), трансмембранного белка семьи (37 белков), а секретированный -белка семьи (8 белков). Only four proteins predicted by PSORT to reside in the cytoplasmic compartment were found in the protease-sensitive fraction ( Supplementary Table 1 online). Только четыре белки предсказывают PSORT проживать в цитоплазматической отделении были обнаружены в протеазы учитывающие долю (дополнительные таблицы 1 в сети). They included the elongation factor Tu, reported to be membrane-associated in other bacteria 20, 21 , two ribosomal proteins, for which there is also evidence of extracellular functions 22, 23 , and a hypothetical protein possibly involved in cell wall localization and side-chain formation. Они включали в себя удлинение фактор Ту, по сообщениям, связанных с мембраной на других бактерий, 20, 21, два рибосомального белков, для которых есть доказательства внеклеточной функций 22, 23, и гипотетическими белка, возможно, участвуют в клеточной стенки локализации и побочные цепочке формирования.
Figure 1. The M1_SF370 surface proteome. Рисунок 1. M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА.
The 72 proteins belonging to the M1_SF370 surface proteome are grouped into families based on their predicted cellular location. 72 белков, входящих в M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА сгруппированы семей на основе их местоположения сотового предсказал. Red areas of each pie indicate the number of PSORT-predicted proteins that have not been found in the surface proteome, whereas the yellow areas represent the number of identified proteins belonging to each protein family. Красный районов каждого пирога указать количество PSORT предсказанных белков, которые не были обнаружены на поверхности ПРОТЕОМА, в то время как желтые районы представляют число выявленных белки, принадлежащие к каждой семье белка. The blue pies illustrate how many of the identified proteins have been confirmed to be surface-exposed by following antigen-specific antibody binding to whole bacterial cells using FACS analysis. Синий пироги показывают, как многие из указанных белков были подтверждены для поверхностного воздействия на следующий конкретный антиген-антитело обязательными для всего бактериальных клеток с помощью СУИМ анализа.
Full Figure and legend (59K) Полный Рисунок и легенда (59K)
Confirmation of protein surface exposure Подтверждение белка поверхности облучения
The almost complete absence of peptides from predicted cytoplasmic proteins suggested that the procedure was selective for the identification of surface-exposed proteins. Почти полное отсутствие пептидов из предсказал цитоплазматических белков высказано мнение, что процедура носит избирательный характер для выявления поверхностных подвергаются белки. To confirm this, we carried out two types of analysis. Чтобы подтвердить это, мы провели два вида анализа. First, we analyzed the 37 transmembrane proteins ( Supplementary Table 1 online) with PSORT topological prediction analysis and asked whether the MS/MS-identified peptides were located within domains predicted to be on the external side of the membrane. Во-первых, мы проанализировали 37 трансмембранный белки (Дополнительный Таблица 1 онлайн) с PSORT Топологический анализ и прогнозирование ли MS / MS-пептидов были определены расположенные в доменах прогнозам, будет на внешнюю сторону мембраны. For 26 out of 37 proteins experimental MS/MS data were consistent with PSORT predictions ( Fig. 2 ). Для 26 из 37 белков экспериментальной MS / MS данные согласуются с прогнозами PSORT (Рис. 2). In contrast, for the remaining 11 proteins, the identified peptides mapped either in domains predicted to be intracellular or, in two cases, embedded in the membrane. В отличие от этого, на оставшиеся 11 белков, пептидов определила карту либо в областях, по прогнозам, будет внутриклеточных или, в двух случаях, встроенных в мембраны. However, from manual inspection of the annotations, we came to the conclusion that the PSORT-predicted transmembrane organization of at least 6 out of 11 proteins ( Supplementary Table 1 online) should be revisited. Однако, начиная с руководства инспекции аннотации, мы пришли к выводу, что предсказал PSORT-трансмембранный организации, по крайней мере 6 из 11 белков (дополнительные таблицы 1 в сети), должны быть пересмотрены. In particular, the two peptides derived from the putative cell division protein Spy0015, homologous to the FtsH protein family, are located within a conserved protein domain known to be extracellular in FtsH proteins 24, 25, 26 . В частности, два пептиды, полученные от предполагаемого клеток белка Spy0015, гомологичен FtsH белкового семейства, находится в сохранение белка домена известно, внеклеточная в FtsH белков 24, 25, 26. The four peptides of Spy1520, a second putative cell division protein homologous to FtsZ, are located within the C-terminal part of the molecule, a region that in Bartonella bacilliformis is immunogenic and surface-exposed 27 . Четыре пептидов Spy1520, второй предполагаемый клеток белка FtsZ гомологичен, расположены в пределах С-терминал часть молекулы, что в регионе Bartonella bacilliformis это иммуногенность и поверхностных подвержены 27. The two hypothetical proteins Spy0351 and Spy2184 are likely to be lipoproteins rather than integral membrane proteins. Две гипотетические белки Spy0351 и Spy2184 могут липопротеидов, а не интегральных мембранных белков. In fact, their predicted transmembrane regions have a very poor PSORT score and therefore we expect them to completely extend out of the membrane. По сути, их предсказал трансмембранный регионы очень плохо PSORT баллов и поэтому мы надеемся, что они полностью продлить из мембраны. This is also supported by the presence, adjacent to their predicted leader-peptide cleavage sites, of the cysteine, which in lipoproteins is used as the anchor residue to the bacterial surface. Это также поддерживается за счет присутствия, прилегающих к их предсказал лидер-пептида спайности объектов, цистеин, которая в липопротеидов используется как якорь остатков на поверхности бактериальных. Spy1154 has two predicted transmembrane regions, the second of which has a very poor PSORT score (-0.32 as opposed to -8.12 of the first transmembrane region). Spy1154 два предсказал трансмембранный регионов, вторая из которых имеет очень плохие PSORT баллов (-0.32 по сравнению с -8,12 из первых трансмембранный обл.) If, as is likely, the prediction of the second transmembrane region were wrong, the C-terminal part of the molecule, which carries a typical sortase domain, would be exposed on the surface, which would be consistent with the mechanism of action of sortases 28 . Если, как это, вероятно, предсказание о втором трансмембранного региона были неправы, то C-терминал часть молекулы, которая несет в себе типичные sortase области, будет выставлена на поверхность, которая будет соответствовать механизм действия sortases 28. Finally, Spy0184, a putative glycine betaine binding–permease protein, is predicted to have six transmembrane regions, one of which has a poor score. Наконец, Spy0184, предполагаемый глицин betaine обязательного-permease белок, согласно прогнозам, иметь шесть трансмембранный регионов, один из которых имеет плохой балл. Again, if the weak transmembrane region were ignored, the topological organization would change and the C-terminal region, where the two MS/MS-identified peptides fall, would become surface-exposed. Опять же, если слабый трансмембранного региона были проигнорированы, Топологический организации изменится и С-концевой области, где два MS / MS-выявлены пептиды осенью, станет поверхности подвергаются. Indeed, polyclonal antibodies against the C-terminal domain of the protein efficiently bound GAS M1_SF370 whole cells when tested by fluorescence-activated cell sorting (FACS; data not shown). Действительно, поликлональные антитела против С-концевого домена из белка эффективно связаны ГАЗ M1_SF370 целом клеток при испытании на флуоресценцию активированных клеток сортировки (СУИМ; данные не показаны).
Figure 2. Topological analysis of the 37 surface-exposed proteins belonging to the membrane protein family. Рисунок 2. Топологические анализ 37 поверхностных белков подвергаются принадлежащие к мембране белкового семейства.
Each of the 37 membrane proteins belonging to the M1_SF370 surface proteome was subjected to PSORT topological prediction. Каждая из 37 мембранных белков, принадлежащих к M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА был подвергнут PSORT Топологический прогнозирования. ( a ) All proteins whose predicted topology is consistent with the experimental data are shown; the proteolytic peptides (shown in red in the figure) derived by protease treatment of whole cells are in fact located on domains protruding out of the membrane. () Все белки которого предсказал топологии согласуются с экспериментальными данными приведены; протеолитических пептидов (показан красным цветом на рисунке), полученных путем протеазы лечения целых клеток, по сути, расположенных на доменах выступающие из мембраны. ( b , c ) Shown are the 11 proteins showing discrepancies between in silico -predicted topology and experimental data (see text for details) and whose identification was deduced from the characterization of more than one ( b ) or one ( c ) peptide. (B, C) показано 11 белков с указанием различий между silico в предсказанным топологии и экспериментальные данные (см. текст в подробности) и идентификация которых была выведена из характеристик более чем одним (б), либо один (с) пептида.
Full Figure and legend (96K) Полный Рисунок и легенда (96K)
The second type of study was based on FACS analysis using protein-specific antibodies. Второй тип исследования была основана на анализе использования СУИМ белково-специфических антител. Mouse polyclonal antibodies were produced against 51 recombinant proteins selected from among the M1_SF370 surface-exposed proteins, and the antibodies were tested for their capacity to bind whole bacteria. Мыши поликлональные антитела были подготовлены в отношении 51 рекомбинантных белков, отобранных из числа M1_SF370 поверхности подвергаются белки и антитела были проверены на их способность связывать весь бактерий. All but seven sera were positive in the assay, confirming surface exposure of the proteins ( Fig. 1 and Supplementary Table 1 online). Все, кроме семи сыворотки были положительными в тесте, подтверждающий поверхностного воздействия на белки (рис. 1 и таблица 1 Дополнительная сети). For the remaining 21 proteins for which antisera were not available, we expect that a similar proportion would also be FACS positive. Для остальных 21 белков, для которых антисывороток не были представлены, мы ожидаем, что аналогичная доля будет также СУИМ положительным. Furthermore, several of the proteins appeared well expressed/exposed on the surface, as judged by fluorescent intensity, which, in some cases, was in the same range as that observed with the major surface antigen, the M protein 29 . Кроме того, некоторые белки, как хорошо выразил / выставлена на поверхность, а судить по флуоресцентной интенсивности, которая в некоторых случаях, в том же диапазоне, что и наблюдается с основными поверхности антиген, М протеин 29.
In conclusion, considering that (i) all proteins identified have a highly significant MASCOT score ( Supplementary Table 1 online), (ii) a large proportion of the 72 proteins is compatible with the corresponding PSORT-predicted localization and topology and (iii) a good match exists between the mass spectrometry data and the FACS data, we believe that the method leads to a reliable list of surface-exposed proteins. В заключение, учитывая, что (я) все выявленные белки имеют весьма важное значение MASCOT баллов (Таблица 1 Дополнительная онлайн), (II), значительная часть из 72 белков, совместимый с соответствующей PSORT-предсказал локализации и топологии и (III) хорошее соответствие между данными масс-спектрометрии и СУИМ данных, мы считаем, что этот метод приводит к надежным список поверхности подвергаются белки. Obviously, we cannot rule out that some of the identified proteins may represent experimental artifacts. Очевидно, что мы не можем исключать, что некоторые из указанных белков может представлять экспериментальные артефакты. In this respect, we have listed the proteins on the basis of the likelihood of being truly exposed on the surface ( Supplementary Table 2 online). В этой связи мы перечислили белки на основе вероятности быть действительно выставлена на поверхность (Дополнительный Таблица 2 сети). The highest probability score can be assigned to 52 proteins in that they were either confirmed by FACS analysis (44 proteins) or, despite the fact that FACS data were not available (5 proteins) or were negative (3 proteins), were identified with more than one peptide. Самая высокая оценка вероятности может быть назначено до 52 белков, в том, что они либо были подтверждены СУИМ анализ (44 белков), либо, несмотря на тот факт, что СУИМ данные не были доступны (5 белков), либо были отрицательными (3 белки), были выявлены более чем одного пептида.
Application to vaccine discovery Применительно к открытию вакцины
From our previous experience with Meningococcus B and group B Streptococcus we know that protective antigens must be well expressed and exposed on the surface of the bacterial cell 8, 9 . Из нашего предыдущего опыта менингококка группы B и B Streptococcus мы знаем, что защитные антигены должны быть четко выражена и воздействию на поверхности бактериальных клеток 8, 9. Hence, the comprehensive analysis of surface-exposed proteins may be an ideal approach to the identification of vaccine candidates. Таким образом, комплексный анализ поверхности подвергаются белки могут быть идеальный подход к выявлению вакцин. In support of this, 7 of the 11 reported GAS protective antigens 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 whose genes are present in M1_SF370 are part of the M1_SF370 surface proteome ( Table 1 ). В подтверждение этого, 7 из 11 сообщили, ГАЗ защитных антигенов, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, чьи гены присутствуют в M1_SF370 являются частью M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА ( Таблица 1). We therefore decided to investigate whether proteins identified here could elicit protective responses in a mouse model of infection and disease. Поэтому мы решили исследовать белки выявлены ли здесь можно было получить ответы на защитные мышь Модель инфекции и болезни. To this end, we analyzed the complete set of surface-exposed proteins of M23_DSM2071, a GAS strain that, unlike M1_SF370, is highly virulent in mice. С этой целью мы проанализировали комплект поверхности подвергаются белки M23_DSM2071, ГАЗ напряжения, что, в отличие от M1_SF370, очень вирулентного у мышей. It should be noted that, because the genome sequence of M23_DSM2071 is not available, only the proteins whose genes are shared with M1_SF370 or any of the other six GAS strains whose sequences are available in the public databases ( http://www.tigr.org/ and http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) could be identified. Следует отметить, что, поскольку геном последовательность M23_DSM2071 не имеется, только белки, гены, которые являются общими с M1_SF370 или любой из других шести ГАЗ штаммы которых последовательностей имеются в государственных базах данных (http://www.tigr. Org / и http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), могут быть идентифицированы. Furthermore, in contrast to M1_SF370, M23_DSM2071 produces a robust amount of capsule (data not shown), which is expected to limit the number of proteins readily accessible to protease action. Кроме того, в отличие от M1_SF370, M23_DSM2071 производит надежные размере капсулы (данные не показаны), который, как ожидается, ограничить количество белков, легко доступных для протеазы действий. A total of 17 proteins were unambiguously identified: 5 cell wall–anchored proteins, 4 lipoproteins, 5 membrane proteins, 2 secreted proteins and 1 cytoplasmic protein ( Table 2 ). В общей сложности из 17 белков были однозначно определены: 5-клеточной стенки закреплена белков, липопротеидов 4, 5 мембранные белки, протеины секретированный 2 и 1 цитоплазматической белка (табл. 2). All of the identified proteins have a homolog in M1_SF370 and all but two (the putative zinc-containing alcohol dehydrogenase and the putative, RofA-related, regulatory protein) were also included in the M1_SF370 surface proteome ( Supplementary Table 1 online). Все выявленные белки имеют homolog в M1_SF370 и все, за исключением двух (мнимых цинк-содержащих алкоголь дегидрогеназа и мнимых, RofA связаны регулирования белка), были также включены в M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА (дополнительные таблицы 1 в сети). Of the 17 proteins specific to M23_DSM2071, 14 proteins were successfully expressed in Escherichia coli as either soluble histidine-fusions or glutathione S -transferase (GST)-fusions ( Table 2 ). Из 17 белков, характерных для M23_DSM2071, 14 белков были успешно выразил в кишечной палочки в виде растворимых гистидин-слияний и глутатион S-трансферазы (GST)-слияний (Таблица 2). Each recombinant protein was used to immunize mice intraperitoneally and the mice were subsequently challenged intranasally with an LD 90 dose (10 6 colony forming units (CFUs) in 50 Каждый рекомбинантного белка была использована для иммунизации мышам внутрибрюшинно и мышами впоследствии были оспорены intranasally с доза ЛД 90 (10 6 колонии формирование подразделений (CFUs) в 50 l) of M23_DSM2071 (LD 90 is defined as the dose that kills 90% of the challenged mice). л) от M23_DSM2071 (LD 90 считается доза, которая убивает 90% оспорило мышей). Two proteins were protective in this model: the M protein (90% survival rate) and Spy0416 (70% survival rate) ( Table 3 ). Две защитные белки были в этой модели: М протеин (90% выживаемости) и Spy0416 (70% выживаемости) (Таблица 3). Spy0416 is a putative cell envelope proteinase carrying a typical cell wall–anchoring LPXTG motif, whose protective activity has never been reported before. Spy0416 является предполагаемый клеток конверт протеиназ перевозящие типичные клеточной стенки-якорь LPXTG мотив, чья защитная деятельность никогда не было сообщено ранее.
Table 1. List of reported group A Streptococcus protective antigens and their identification in the M1_SF370 surface proteome Таблица 1. Список зарегистрированных группы Streptococcus защитных антигенов и их идентификации в M1_SF370 поверхностных ПРОТЕОМА
Full Table Полная таблица
Table 2. Surface proteome of group A Streptococcus M23_DSM2071 strain and comparison with the M1_SF370 surface proteome Таблица 2. Поверхность ПРОТЕОМА группы Streptococcus M23_DSM2071 деформации и сравнение с M1_SF370 поверхность ПРОТЕОМА
Full Table Полная таблица
Table 3. Protective activity of Spy0416 Таблица 3. Защитные деятельности Spy0416
Full Table Полная таблица
Top Верх
Discussion Обсуждение
In silico analysis of the complete sequence of >100 bacterial genomes predicts that surface-associated proteins constitute between 30% and 40% of all bacterial proteins. В silico анализ полной последовательности> 100 бактериальных геномов, предсказывает, что поверхностно-ассоциированных белков составляют от 30% до 40% всех бактериальных белков. A considerable proportion of these proteins are poorly characterized in terms of function, level and kinetics of expression, and topology. Значительная часть этих белков плохо с точки зрения функций, уровня и кинетика выражения и топологии. Surface proteins of several bacteria have been analyzed using a variety of proteomic approaches. Поверхностные белки некоторых бактерий, были проанализированы с использованием разнообразных протеомических подходов. However, reliable methods capable of providing detailed pictures of surface protein organization in bacteria are still unavailable. Вместе с тем, надежных методов, способных оказать подробные фотографии поверхности белка организации бактерий по-прежнему недоступна. Particularly challenging has been the identification of the pools of proteins that extend beyond the cell wall and polysaccharide capsule and constitute a subgroup of membrane proteins that are expected to play key roles in communicating and interacting with the environment. Особенно сложным было определение бассейны белков, которые выходят за стены клеток и полисахаридов капсулы и представляют собой подгруппу мембранных белков, которые, как предполагается, играют ключевую роль в общении и взаимодействии с окружающей средой. Moreover, in pathogenic bacteria these proteins are the most promising vaccine candidates, as we also have recently demonstrated 8, 9 . Кроме того, патогенные бактерии, эти белки являются наиболее перспективных вакцин-кандидатов, а также недавно продемонстрировали 8, 9.
GAS is responsible for a variety of clinical syndromes, ranging from uncomplicated pharyngitis and impetigo to pneumonia, sepsis, necrotizing fasciitis and streptococcal toxic shock syndrome. ГАЗ отвечает за целый ряд клинических синдромов, от незатрудненного фарингита и импетиго на пневмонию, сепсис, некротический фасцит и стрептококковый синдрома токсического шока. Furthermore, untreated streptococcal pharyngitis and skin infections may lead to acute rheumatic fever, chronic rheumatic heart disease and acute glomerulonephritis 42 . Кроме того, неочищенные стрептококковый фарингит и кожные инфекции может привести к острой ревматической атаки, хронические ревматические болезни сердца и острый гломерулонефрит 42. Despite the importance of this pathogen, to the best of our knowledge, the systematic analysis of its surface antigens is limited to one publication 43 in which the authors analyzed mutanolysin cell wall extracts of three different GAS strains by a combination of 2D gel/mass spectrometry analysis and immunoblots with human sera. Несмотря на важность этого патогена, насколько нам известно, систематический анализ ее поверхностных антигенов ограничивается одной публикации 43, в которой авторы проанализировали mutanolysin клеточной стенки экстрактов трех различных штаммов ГАЗ на сочетание 2D гель / масс-спектрометрии анализ и immunoblots с человеческой сыворотки. The drawback of this approach is that digestion of the peptidoglycan cell wall increases susceptibility to lysis and release of cytoplasmic proteins. Недостаток такого подхода заключается в том, что пищеварение в peptidoglycan клеточной стенки увеличивается восприимчивость к лизис и высвобождение цитоплазматических белков. In fact, of the 74 proteins identified in these experiments, 75% were predicted to be cytoplasmic and less than 25% were experimentally demonstrated to be on the surface. В самом деле, из 74 протеинов, выявленных в этих экспериментах, 75% из них были по прогнозам, будет цитоплазматической и менее чем на 25% было экспериментально доказано, что на поверхности.
The approach described here provides the most extensive and detailed map of the surface-exposed antigens of a GAS isolate to date. Подход, описанный здесь, представляет собой наиболее обширную и подробную карту поверхности дозы антигена ГАЗ выделить на сегодняшний день. Of the 72 surface-exposed proteins identified in the M1_SF370 strain, 95% were predicted to belong to the categories of cell wall–anchored proteins, lipoproteins, transmembrane-spanning proteins and secreted proteins. Из 72 поверхностных белков подвергаются определенным в M1_SF370 деформации, 95% из них были прогнозам относятся к категории клеточной стенке закреплена-белков, липопротеидов, трансмембранный охватывающие белки и белки секретированный. Genome analysis predicts that the numbers of GAS M1_SF370 proteins constituting these protein families are 17, 28, 561 and 83, respectively ( Fig. 1 ). Геном анализ предсказывает, что число ГАЗ M1_SF370 этих белков, составляющих белка семей 17, 28, 561 и 83, соответственно (рис. 1). Therefore, although a large proportion of all predicted cell wall–anchored proteins and lipoproteins were identified (70% and 40%, respectively), only a small fraction (6.5%) of these were transmembrane proteins. Таким образом, хотя значительная доля всех предсказал-клеточной стенки закреплена белков и липопротеидов были выявлены (70% и 40% соответственно), лишь небольшая часть (6,5%) из них были трансмембранный белков. This indicates that the majority of these proteins are deeply embedded in the membrane and/or hidden by cell wall components, are poorly expressed or both. Это свидетельствует о том, что большинство из этих белков глубоко встроенных в мембраны и / или скрыты компоненты клеточной стенки, слабо выраженные или обоих. Although we cannot rule out that some membrane-associated proteins were not identified because they are either too resistant or too sensitive to protease digestion, we believe that the number of false-negative proteins is limited. Хотя мы не можем исключать, что некоторые мембранных белков, связанных не были определены, поскольку они являются либо слишком устойчивы или слишком чувствительны к протеазы пищеварение, мы считаем, что количество ложных отрицательных белков ограничено. First, most of the cell wall proteins and lipoproteins, which are designed to extend out of the membrane, were identified, whereas very few secreted proteins were identified; this is in keeping with the notion that only a minor fraction of secreted proteins remain associated with the bacteria. Во-первых, большая часть клеточной стенки белков и липопротеидов, которые призваны расширить из мембраны, были определены, в то время очень мало выделяется белков было выявлено, что в соответствии с тем, что лишь незначительная часть выделяется белки остаются связанными с бактерии. Second, no biochemical or structural reasons are known that make membrane proteins either more sensitive or more resistant to protease treatment than the cell wall proteins and lipoproteins are. Во-вторых, нет биохимических или структурных причин, как известно, что мембранные белки делать либо более чувствительны и более устойчивы к лечению, чем протеазы клеточной стенки белков и липопротеидов являются. Moreover, we have recently described the presence of pili in GAS and we have shown that pili correspond to the trypsin-resistant T antigens described by Lancefield and used for serotyping of GAS isolates 30 . Кроме того, мы недавно описал присутствие Пили в газе и мы показали, что Пили соответствуют трипсин устойчивостью T антигенов описывается Lancefield и используется для serotyping газа изолятах 30. Despite their trypsin-resistant nature, thanks to the use of more than one protease in the shaving step, the pilin proteins (NT01SP0102 and Spy0128) were part of the surface proteome ( Supplementary Table 1 online). Несмотря на их трипсин устойчивый характер, благодаря использованию более одного протеазы в бритвенный шаг, pilin белки (NT01SP0102 и Spy0128) были частью поверхности ПРОТЕОМА (Таблица 1 Дополнительные сети). Therefore, even the most recalcitrant proteins could be identified. Поэтому, даже самые непокорные белков могут быть выявлены.
Several membrane proteins are known to be shielded by other surface-exposed protein complexes and, in the case of capsulated bacteria, by the polysaccharide capsule that surrounds the bacterial cells. Несколько мембранных белков, как известно, экранированный другие поверхности подвергаются белковые комплексы, и, в случае capsulated бактерий путем полисахаридной капсула, которая окружает бактериальной клетки. In line with this, M23_DSM2071, a strain which produces more capsule than M1_SF370, was found to contain a relatively small number of surface-exposed proteins (17) compared to the 72 proteins of M1_SF370. В соответствии с этим, M23_DSM2071, штамм, который производит больше, чем капсулы M1_SF370, было установлено, содержат относительно небольшое количество поверхности подвергаются белки (17) по сравнению с 72 белков M1_SF370. Furthermore, we have recently found that M3_CDCSS-90, a highly virulent strain that, when grown in liquid culture, has three times as much capsular polysaccharide as M1_SF370 (data not shown), contained only ten major surface-exposed proteins ( Supplementary Table 3 online). Кроме того, недавно мы обнаружили, что M3_CDCSS-90, весьма вирулентных штаммов, что, когда выросли в жидкой культурой, имеет в три раза больше капсульные полисахаридной как M1_SF370 (данные не показаны), которые содержатся только в десяти крупных поверхности подвергаются белки (Дополнительный Таблица 3 сети). Although the genome sequences of both M3_CDCSS-90 and M23_DSM2071 are not available and therefore a few proteolytic peptides could not have been identified because of the sequence variation and gene variability within strains, overall our data indicate that the capsule plays a role in determining the extent of protein accessibility on the bacterial surface. Несмотря на то, что последовательность генома, так M3_CDCSS-90 и M23_DSM2071 не доступны, и поэтому несколько протеолитических пептидов не могли быть выявлены в результате вариаций последовательности генов и изменчивость в штаммы, в целом наши данные свидетельствуют о том, что капсула играет роль в определении степени белка доступность по бактериальной поверхности. This is consistent with what we have recently demonstrated for a group B Streptococcus protein, which was only accessible to antibody recognition in a capsule-negative mutant, and not in the parental wild-type encapsulated strain 9 . Это согласуется с тем, что мы недавно продемонстрировали в группе B Streptococcus белка, которая была доступна только на антитела к признанию в капсуле-негативного мутанта, а не на родителей дикого штамма инкапсулированные 9.
An important aspect of the approach proposed here is its utility in refining the protein topology derived from computer-assisted predictors such as PSORT. Важным аспектом предлагаемого подхода заключается в его полезность уточнения топологии белка, полученных из компьютера с помощью предсказателей, таких, как PSORT. Because the procedure selectively identifies peptides proteolytically generated from surface-exposed domains, by matching the topology prediction with peptide data, one can either confirm or refine the membrane organization of each identified protein. Поскольку процедура избирательно определяются пептидов proteolytically полученные от поверхности подвергаются областях, в соответствие с топологией прогнозирования пептид данные можно либо подтвердить или уточнить мембраны организации каждому из выявленных белка. In general, we found a good correlation between theoretical and experimental data. В общем, мы нашли хорошую корреляцию между теоретическими и экспериментальными данными. However, the topology of 30% of the transmembrane proteins identified did not fit with peptide data. Вместе с топологией 30% белков трансмембранный определил не соответствуют пептид данных. Manual inspection of each transmembrane protein highlighted the difficulty that algorithms such as PSORT encounter in assigning topological organization of proteins carrying transmembrane regions with low probability scores. Ручная проверка каждой трансмембранного белка подчеркнул, что сложность алгоритмов, таких, как PSORT столкнуться в присвоении Топологический организации белков, перевозящих трансмембранный регионах с низкой вероятностью очков. In this respect, the procedure could be successfully used in future refinements of current algorithms. В связи с этим процедуры могут быть успешно использованы в будущем уточнений существующих алгоритмов.
The search for effective vaccines to prevent group A streptococcal infections has been ongoing for many decades. Поиск эффективных вакцин для предотвращения стрептококкового группу инфекций была постоянной в течение многих десятилетий. Based on the original observation by Lancefield 44 that protection against GAS correlates in humans with the levels of bactericidal antibodies, the search for vaccine candidates has been focused on surface antigens. Основываясь на оригинальной замечание Lancefield 44 о том, что защита от ГАЗ соотносится у людей с уровнем антител бактерицидно, поиски вакцины кандидатов была сосредоточена на поверхности антигены. Indeed, the most promising vaccine candidate so far described is the surface M protein, which is a primary virulence determinant and which is used for GAS serotyping 45 . Действительно, наиболее перспективным кандидатом вакцины до сих пор описанных является поверхности М протеин, который является одним из основных факторов, определяющих вирулентность, и который используется для ГАЗ serotyping 45. However, the M protein is a highly variable antigen such that GAS is currently classified in more than 100 different serotypes. Тем не менее, М белка высоко переменная антиген таким образом, чтобы газ в настоящее время классифицируются в более чем 100 различных серотипов. Therefore, although vaccine studies based on M protein are well underway 2, 46 , the identification of other, more conserved protective surface antigens would be highly desirable. Поэтому, хотя исследования вакцин основано на М белка хорошо по 2, 46, выявление других, более сохранение защитных поверхностных антигенов бы весьма желательным. A relevant result from our work is the demonstration that comprehensive characterization of surface-exposed proteins can lead to new vaccine candidate discovery. Соответствующим результатом нашей работы является демонстрацией, что всесторонняя характеристика поверхности подвергаются белки могут привести к новой вакцине кандидата открытий. Among the 14 identified surface proteins tested, one protein, Spy0416, conferred high protection levels. Из 14 выявленных поверхностных белков испытания, один белок, Spy0416, присудил высокие уровни защиты. This is a remarkable result, considering the paucity of protective antigens that have been identified to date. Это замечательный результат, учитывая скудость защитных антигенов, которые были определены на сегодняшний день. Spy0416 is a 1,647 amino acid cell wall protein, which shares 48% similarity with the C5a peptidase precursor and has a calcium-dependent serine protease activity 47 . Spy0416 является 1647 аминокислот белка клеточной стенки, которая разделяет 48% сходства с C5a peptidase прекурсоров и кальций-зависимых протеаз серин деятельности 47. Spy0416 has a homolog in group B Streptococcus (cspA) that was proposed to be involved in virulence by potentially protecting the bacterium from opsonophagocytic killing 48 . Spy0416 имеет homolog в группе B Streptococcus (cspA), что было предложено принять участие в вирулентности потенциально защитить бактерии от opsonophagocytic убив 48. Interestingly, Lei and coworkers recently found that a 31-kDa, N-terminal fragment of Spy0416 is released in the supernatant of GAS cultures and that the protein is well recognized by sera from GAS-infected patients 49 . Интересно, лей и коллегами недавно обнаружил, что 31-кДа, N-концевой фрагмент Spy0416 выпущена в супернатант ГАЗ культуры и что белков хорошо признана сывороток от ГАЗ-инфицированных пациентов, 49. Based on the seven available genome sequences, the protein appears to be highly conserved (over 98% identity) and preliminary data on surface expression on a panel of 20 different GAS strains indicate that Spy0416 is a major component of over 70% of circulating strains (SC and GB, unpublished data). Исходя из семи имеющихся последовательностей генома, белково-видимому, сохраняется высокой (свыше 98% личности), и предварительные данные о поверхности выражение Группа ГАЗ 20 различных штаммов Spy0416 указывают на то, что является важным компонентом более 70% циркулирующих штаммов ( SC и ГБ, неопубликованные данные).
Top Верх
Methods Методы
Bacterial surface digestion. Бактериальные поверхности пищеварение.
Streptococcus pyogenes M1_SF370, M3_CDCSS-90 and M23_DSM2071 (DSMZ) were grown in Todd-Hewitt broth (THB) at 37 °C and 5% CO 2 , until an OD 600 of 0.4 (exponential phase) was reached. Streptococcus pyogenes M1_SF370, M3_CDCSS-90 и M23_DSM2071 (DSMZ) были выращены в Тодд-хьюиттовские бульоне (THB) при 37 ° С и 5% CO 2, до тех пор, пока ОД 600 0.4 (экспоненциальной фазе) была достигнута. Bacteria were harvested by centrifugation at 3,500 g for 10 min at 4 °C, and washed three times with PBS. Бактерии были заготавливаемым путем центрифугирования в 3500 г в течение 10 мин при 4 ° C, и три раза промывают с PBS. Cells were resuspended in one-hundredth volume of PBS containing 40% sucrose (pH 7.4 for trypsin digestion and pH 6.0 for proteinase K digestion). Клетки были resuspended в одной сотой объема PBS, содержащий 40% сахарозы (рН 7.4 для трипсин пищеварение и рН 6.0 для протеиназы К пищеварения). Digestions were carried out with 20 Digestions были проведены с 20 g trypsin (Promega) or 5 г трипсина (Promega) или 5 g proteinase K (Sigma) in the presence of 5 mM DTT, for 30 min at 37 °C. г протеиназы К (Sigma), в присутствии 5 мМ DTT, в течение 30 мин при 37 ° C. The digestion mixtures were centrifuged at 3,500 g for 10 min at 4 °C, and the supernatants (containing the peptides) were filtered using 0.22- Сбраживание смеси центрифугировали в 3500 г в течение 10 мин при 4 ° C, и supernatants (содержащий пептиды) были отфильтрованы с помощью 0.22 - m pore-size filters (Millipore) . м поровое размер фильтров (Millipore). Protease reactions were stopped with formic acid at 0.1% final concentration. Протеазы реакции были остановлены с муравьиной кислоты на 0,1% окончательный концентрации. Before analysis, salts were removed by off-line high-performance liquid chromatography (HPLC), with a 7-min gradient of 2–80% acetonitrile in 0.1% formic acid. Перед анализом, соли были удалены оффлайн высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), с 7-мин градиентом 2-80% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоты. Peptide fractions were concentrated with a Speed-vac centrifuge (Savant) , and kept at -20 °C until further analysis. Пептидов фракции были сконцентрированы с Speed-VAC центрифуг (Savant), и хранится при температуре -20 ° C до дальнейшего анализа.
Protein identification technology by nano-LC/MS/MS. Белки определение технологии nano-LC/MS/MS.
Two different platforms were used for the chromatographic separation of peptides and further identification by tandem mass spectrometry (MS/MS). Два разных платформах используются для хроматографического разделения пептидов и дальнейшее выявление тандем масс-спектрометрия (MS / MS). In the first, peptides were separated by 2-D-nano-liquid chromatography (LC; Dionex). Во-первых, пептиды были разделены на 2-D-нано-жидкостной хроматографии (LC; Dionex). In the first dimension, peptides were loaded on a strong cation exchange (SCX) column (10 cm В первом измерении, пептиды были погружены на сильные катионообменной (SCX) колонки (10 см 320 320 m inner diameter (id), packed with cross-linked particles functionalized with sulfoethyl groups) and eluted isocratically by applying five NaCl solutions of increasing concentrations (0.01, 0.05, 0.1, 0.5 and 1 M). м внутренний диаметр (ID), упакованные в сшитых частиц функционализированных с sulfoethyl групп) и eluted isocratically путем применения пяти NaCl решений увеличения концентрации (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 и 1 м). In the second dimension, peptides were separated by a reversed-phase C18 analytical column (15 cm Во второй аспект, пептиды были разделены вспять этапа C18 аналитические колонки (15 см 75 75 m id, C18 PepMap100, 3 м ID, C18 PepMap100, 3 m, 100 Å) through a C18 trap column (PepMap C18 м, 100 а) C18 ловушку колонка (PepMap C18 -precolumn, 300 -precolumn, 300 m id м ID 1 mm). 1 мм). Peptides were eluted with a 45-min gradient of 5–50% of 80% acetonitrile in 0.1% formic acid at a flow rate of 300 nl/min. Пептиды были eluted с 45-минутной градиентом 5-50% до 80% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоты на скорость потока 300 NL / мин. Eluates were continuously spotted onto an Anchor-Chip matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) target (Bruker Daltoniks), prepared with a thin layer of a saturated solution of Eluates постоянно заметили на Якорь Чип-матрицы с помощью лазерной десорбции ионизации (MALDI) целевая (Bruker Daltoniks), подготовленный с тонким слоем насыщенного решения -cyano-4-hydroxycynnamic acid in acetone, every 60 s using a Proteineer FC robot (Bruker Daltoniks). -циано-4-hydroxycynnamic кислоты в ацетоне, каждые 60 сек, используя Proteineer ФК робот (Bruker Daltoniks). After fraction collection, every spot was manually recrystallized with 0.6 После фракция коллекции, каждые месте был вручную recrystallized с 0,6 l of ethanol/acetone/0.1% trifluoroacetic acid (6:3:1). л ethanol/acetone/0.1% трифторуксусной кислоты (6:3:1). Mass spectrometry analysis was performed automatically with an Ultraflex MALDI-time-of-flight (TOF) instrument, under the control of the WARP LC software, version 1.0 (Bruker Daltoniks). Масс-спектрометрия анализ производится автоматически при Ultraflex MALDI-время-от-рейс (TOF) документа, под контролем WARP LC программного обеспечения, версия 1.0 (Bruker Daltoniks). First, MS spectra of all the spotted fractions were acquired for peak selection over the m/z range of 900–4,000, after which MS/MS spectra of selected peaks were obtained. Во-первых, MS спектры всех пятнистых фракций были приобретены на пик отбора более м / Z диапазоне 900-4000, после чего MS / MS спектры отдельных пиков были получены. After spectra acquisition, the individual MS/MS spectra acquired for each of the precursor ions were combined, smoothed and centroided using FlexAnalysis software, version 2.4 (Bruker Daltoniks), and then transferred to BioTools software, version 3.0 (Bruker Daltoniks) to create a batch .xml file containing the peak lists of any of the individual MS/MS spectra. После приобретения спектров, индивидуальный MS / MS спектрам приобрел для каждого из прекурсоров ионов были объединены, и сглаженный centroided использованием FlexAnalysis программного обеспечения, версия 2.4 (Bruker Daltoniks), а затем перевели в BioTools программного обеспечения, версия 3.0 (Bruker Daltoniks), чтобы создать партии. XML-файл, содержащий пик списках какой-либо из отдельных MS / MS-спектров. Search and identification of peptides were performed in batch mode with a licensed version of MASCOT, in a local database containing the 1,819 proteins derived from the complete genome sequences of S. Поиск и идентификация пептидов были выполнены в пакетном режиме с лицензированной версии MASCOT, в локальной базе данных, содержащей 1819 белков, полученных от полной последовательности генома С. pyogenes (downloaded from http://www.tigr.org/ and http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ). pyogenes (скачать с http://www.tigr.org/ и http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The MASCOT search parameters were (i) species, S. MASCOT поиска параметров (I) видов, С. pyogenes strain SF370; (ii) allowed number of missed cleavages (only for trypsin digestion), 6; (iii) variable post-translational modifications, methionine oxidation; (iv) peptide tolerance, pyogenes штамма SF370; (II) позволили число пропущенных раскол (только для трипсин пищеварение), 6 (III) переменной пост-трансляционной модификации, метионин окисления (IV) пептид терпимости, 100 ppm; (v) MS/MS tolerance, 100 частей на миллион; (V), MS / MS терпимости, 0.75 Da and (vi) peptide charge, +1. 0,75 Да и (VI) пептид заряд, 1. Only significant hits as defined by MASCOT probability analysis were considered. Единственное существенное хиты, как это определено MASCOT вероятность анализа были рассмотрены. The score thresholds for acceptance of protein identifications from at least one peptide were set by MASCOT as 18 for trypsin digestion and 36 for proteinase K digestion. Оценка пороговых уровней для принятия идентификации белка по крайней мере одного пептида были установлены в качестве MASCOT 18 трипсин пищеварение и 36 для протеиназы К пищеварение.
In the second platform, peptides were separated by nano-LC on a CapLC HPLC system (Waters) connected to a Q-ToF Micro Electron Spray Ionization (ESI) mass spectrometer equipped with a nanospray source (Waters). Во второй платформы, пептиды были разделены нано-LC на CapLC ВЭЖХ системы (Вода), подключенной к Q-TOF Micro Electron Брызгатель ионизации (ESI) масс-спектрометр, оснащенных nanospray источников (воды). Samples were loaded onto an Atlantis C18 NanoEase column (100 Пробы были погружены на Атлантис C18 NanoEase колонке (100 m id м ID 100 mm, Waters), through a C18 trap column (300 100 мм, воды), через C18 ловушка колонке (300 m id м ID 5 mm, Dionex). 5 мм, Dionex). Peptides were eluted with a 50-min gradient of 2–60% of 95% acetonitrile, in a solution of 0.1% formic acid at a flow rate of 400 nl/min. Пептиды были eluted с 50-минутной градиентом 2-60% от 95% ацетонитрила в растворе 0,1% муравьиной кислоты на скорость потока 400 NL / мин. The eluted peptides were subjected to an automated data-dependent acquisition program, using the MassLynx software , version 4.0 (Waters), where a MS survey scan was used to automatically select multicharged peptides over the m/z range of 400–2,000 for further MS/MS fragmentation. Eluted пептиды подвергаются автоматизированной данные, зависящие от приобретения программу, используя программное обеспечение MassLynx, версия 4.0 (Вода), в которых MS опроса сканирования используется для автоматического выбора многозарядный пептиды более м / Z диапазоне 400-2000 для дальнейшего MS / MS фрагментации. Up to three different components were subjected to MS/MS fragmentation at the same time. До трех различных компонентов, подвергались MS / MS фрагментации в то же время. For all the samples, a second nano-LC-MS/MS analysis was carried out for the selective fragmentation of mono-charged peptide species. Для всех образцов, второй nano-LC-MS/MS Анализ проводился на выборочной фрагментации моно-пептида заряженных видов. After data acquisition, the individual MS/MS spectra were combined, smoothed and centroided by MassLynx. После получения данных, отдельные MS / MS спектры были объединены, и сглаженный centroided по MassLynx. Search and identification of peptides were performed in batch mode with a licensed version of MASCOT, in a local database (see above), after converting the acquired MS/MS spectra in .pkl file. Поиск и идентификация пептидов были выполнены в пакетном режиме с лицензированной версии MASCOT в локальной базе данных (см. выше), после преобразования приобрели MS / MS спектров. PKL файл. The MASCOT search parameters were (i) species, S. MASCOT поиска параметров (I) видов, С. pyogenes genome sequences; (ii) allowed number of missed cleavages (only for trypsin digestion), 6; (iii) variable post-translational modifications, methionine oxidation; (iv) peptide tolerance, 500 ppm; (v) MS/MS tolerance, 0.3 Da and (vi) peptide charge, from +1 to +4. As for the previous platform, only significant hits as defined by MASCOT probability analysis were considered. The score thresholds for acceptance of protein identifications from at least one peptide were set by MASCOT as 18 for trypsin digestion and 36 for proteinase K digestion.
Expression and purification of GAS proteins and preparation of immune sera.
Cloning, expression and purification of recombinant proteins, and preparation of immune sera, were performed as described 9 . Briefly, the chromosomal DNA of M1_SF370 was used for gene amplification. PCR primers were designed so as to amplify genes without predicted signal-peptide coding sequences. PCR products were introduced into plasmid expression vectors so as to generate recombinant proteins fused either with 6-His or glutathione GST. His-tagged proteins were obtained by cloning in pET21b+ vectors (Novagen). E. coli BL21DE3 cells (Novagen) were used as the recipient. GST fusions were obtained by using pGEX-NN plasmids and E. coli BL21SI (Novagen) as the recipient. Affinity-purified proteins (three doses of 20 g/dose) were used to immunize groups of adult CD1 mice (six mice per group). Mice were bled 2 weeks after the third immunization. The sera of each group were pooled and stored at -80 °C.
Capsule quantification by colorimetric assay.
GAS strains were grown in 10 ml of THB and when the cultures reached an OD 600 of 0.4, cells were collected by centrifugation, washed twice with PBS and resuspended in 0.5 ml H 2 O. Hyaluronic acid polysaccharide was extracted twice by adding an equal volume of chloroform, and the organic phase was collected by centrifugation. For hyaluronic acid determination, 100 l of properly diluted organic phase were added to 1.9 ml of a solution containing 0.2% (wt/vol) Stains All Reagent (Sigma), 0.6% acetic acid and 50% formamide, and absorbance was measured at 640 nm and compared with the standard curve of hyaluronic acid experimentally defined using known amounts of polysaccharide.
FACS analysis of surface proteins.
Bacteria were grown in THB to an OD 600 of 0.4, washed twice with PBS, suspended in newborn calf serum ( NCS , Sigma), incubated for 20 min at 23 °C and dispensed into a 96-well (20 l/well). Eighty l of preimmune or immune mouse sera, diluted in PBS containing 0.1% BSA, was added to the bacterial suspension to a final dilution of 1:200 and incubated on ice for 30 min. After washing twice with 0.1% BSA in PBS, bacteria were incubated on ice for 30 min in 10 l of goat anti-mouse IgG , F(ab') 2 fragment-specific-R-phycoerythrin-conjugated (Jackson Immunoresearch Laboratories) diluted 100-fold in PBS containing 0.1% BSA, 20% NCS. After incubation, bacteria were washed with PBS/0.1% BSA, suspended in 200 l PBS and analyzed using a FACS Calibur cytometer (Becton Dickinson) and Cell Quest Software (Becton Dickinson) .
Screening of protective antigens in the mouse model.
Five-week-old female CD1 mice (ten mice/group) were immunized with 20 g of recombinant proteins administered intraperitoneally at 0, 21 and 35 d with complete Freund adjuvant (priming dose) and incomplete Freund adjuvant (booster doses). Blood samples were collected before the first and after the third immunizations. Immunized mice were challenged intranasally with 50 l of THB containing 10 6 CFUs of M23_DSM 2071 strain grown in THB broth at an OD 600 of 0.4. CFU number of the infecting dose was verified by plating on 5 TH plates supplemented with 0.5% yeast extract and 5% defibrinated sheep blood. After challenge, mice were controlled daily for survival and the final survival rate was calculated 10 d thereafter.
Note: Supplementary information is available on the Nature Biotechnology website .
Top
Received 10 August 2005; Accepted 18 November 2005; Published online: 15 January 2006.
REFERENCES
Lindahl, G. , Stalhammar-Carlemalm, M. & Areschoug, T. Surface proteins of Streptococcus agalactiae and related proteins in other bacterial pathogens. Clin. Microbiol. Rev. 18 , 102–127 (2005). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Courtney, HS , Dale, JB & Hasty, DL in Handbook of Bacterial Adhesion: Principles, Methods and Applications (eds. An, YN & Friedman, RJ) 553–579 (Human Press, Totowa, NJ, 2002).
Lin, J. , Huang, S. & Zhang, Q. Outer membrane proteins: key players for bacterial adaptation in host niches. Microbes Infect. 4 , 325–331 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Niemann, HH , Schubert, WD & Heinz, DW Adhesins and invasins of pathogenic bacteria: a structural view. Microbes Infect. 6 , 101–112 (2004). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Ton-That, H. , Marraffini, LA & Schneewind, O. Protein sorting to the cell wall envelope of Gram-positive bacteria. Biochim. Biophys. Acta 1694 , 269–278 (2004). | PubMed | ISI | ChemPort |
Janulczyk, R. & Rasmussen, M. Improved pattern for genome-based screening identifies novel cell wall–attached proteins in gram-positive bacteria. Infect. Immun. 69 , 4019–4026 (2001). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Galperin, MY & Koonin, EV Searching for drug targets in microbial genomes. Curr. Opin. Biotechnol. 10 , 571–578 (1999). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Pizza, M. et al . Identification of vaccine candidates against serogroup B meningococcus by whole-genome sequencing. Science 287 , 1816–1820 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Maione, D. et al . Identification of a universal group B Streptococcus vaccine by multiple genome screen. Science 309 , 148–150 (2005). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Nakai, K. Protein sorting signals and prediction of subcellular localization. Adv. Protein Chem. 54 , 277–344 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Doytchinova, IA , Taylor, P. & Flower, DR Proteomics in vaccinology and immunobiology: an informatics perspective of the immunone. J. Biomed. Biotechnol. 2003 , 267–290 (2003). | PubMed |
Molloy, MP et al . Proteomic analysis of the Escherichia coli outer membrane. Eur. J. Biochem. 267 , 2871–2881 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Phadke, ND et al . Analysis of the outer membrane proteome of Caulobacter crescentus by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics 1 , 705–720 (2001). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Molloy, MP et al . Profiling the alkaline membrane proteome of Caulobacter crescentus with two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics 2 , 899–910 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Nouwens, AS et al . Complementing genomics with proteomics: the membrane subproteome of Pseudomonas aeruginosa PAO1. Electrophoresis 21 , 3797–3809 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Rhomberg, TA et al . Proteomic analysis of the sarcosine-insoluble outer membrane fraction of the bacterial pathogen Bartonella henselae . Proteomics 4 , 3021–3033 (2004). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Sabarth, N. et al . Identification of surface proteins of Helicobacter pylori by selective biotinylation, affinity purification, and two-dimensional gel electrophoresis. J. Biol. Chem. 277 , 27896–27902 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Guina, T. et al . Proteomic analysis of Pseudomonas aeruginosa grown under magnesium limitation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14 , 742–751 (2003). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Ferretti, JJ et al . Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes . Proc. Natl Acad. Sci. USA 98 , 4658–4663 (2001). | Article | PubMed | ChemPort |
Marques, MA , Chitale, S. , Brennan, PJ & Pessolani, MC Mapping and identification of the major cell wall-associated components of Mycobacterium leprae . Infect. Immun. 66 , 2625–2631 (1998). | PubMed | ISI | ChemPort |
Dallo, SF , Kannan, TR , Blaylock, MW & Baseman, JB Elongation factor Tu and E1 beta subunit of pyruvate dehydrogenase complex act as fibronectin binding proteins in Mycoplasma pneumoniae . Mol. Microbiol. 46 , 1041–1051 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Spence, JM & Clark, VL Role of ribosomal protein L12 in gonococcal invasion of Hec1B cells. Infect. Immun. 68 , 5002–5010 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Kurar, E. & Splitter, GA Nucleic acid vaccination of Brucella abortus ribosomal L7/L12 gene elicits immune response. Vaccine 15 , 1851–1857 (1997). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Tomoyasu, T. et al . Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli . J. Bacteriol. 175 , 1352–1357 (1993). | PubMed | ISI | ChemPort |
Akiyama, Y. , Kihara, A. , Mori, H. , Ogura, T. & Ito, K. Roles of the periplasmic domain of Escherichia coli FtsH (HflB) in protein interactions and activity modulation. J. Biol. Chem. 273 , 22326–22333 (1998). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Amara, RR , Shanti, S. & Satchidanandam, V. Characterization of novel immunodominant antigens of Mycobacterium tuberculosis . Microbiology 144 , 1197–1203 (1998). | PubMed | ISI | ChemPort |
Padmalayam, I. , Anderson, B. , Kron, M. , Kelly, T. & Baumstark, B. The 75-kilodalton antigen of Bartonella bacilliformis is a structural homolog of the cell division protein FtsZ. J. Bacteriol. 179 , 4545–4552 (1997). | PubMed | ISI | ChemPort |
Paterson, GK & Mitchell, TJ The biology of Gram-positive sortase enzymes. Trends Microbiol. 12 , 89–95 (2004). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lancefield, RC Studies on the antigenic composition of group A hemolytic Streptococci . J. Exp. Med. 78 , 465–476 (1943). | Article | ChemPort |
Mora, M. et al . Group A Streptococcus produce pilus-like structures containing protective antigens and Lancefield T antigens. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102 , 15641–15646 (2005). | Article | PubMed | ChemPort |
Stalhammar-Carlemalm, M. , Areschoug, T. , Larsson, C. & Lindahl, G. The R28 protein of Streptococcus pyogenes is related to several group B streptococcal surface proteins, confers protective immunity and promotes binding to human epithelial cells. Mol. Microbiol. 33 , 208–219 (1999). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Reid, SD et al . Postgenomic analysis of four novel antigens of group A Streptococcus : growth phase-dependent gene transcription and human serologic response. J. Bacteriol. 184 , 6316–6324 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
McMillan, DJ et al . Identification and assessment of new vaccine candidates for group A streptococcal infections. Vaccine 22 , 2783–2790 (2004). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Ji, Y. , Carlson, B. , Kondagunta, A. & Cleary, PP Intranasal immunization with C5a peptidase prevents nasopharyngeal colonization of mice by the group A Streptococcus . Infect. Immun. 65 , 2080–2087 (1997). | PubMed | ISI | ChemPort |
Massell, BF , Michael, JG , Amezcua, J. & Siner, M. Secondary and apparent primary antibody responses after group A streptococcal vaccination of 21 children. Appl. Microbiol. 16 , 509–518 (1968). | PubMed | ISI | ChemPort |
Dale, JB , Chiang, EY , Liu, S. , Courtney, HS & Hasty, DL New protective antigen of group A Streptococci . J. Clin. Invest. 103 , 1261–1268 (1999). | PubMed | ISI | ChemPort |
Kawabata, S. et al . Systemic and mucosal immunizations with fibronectin-binding protein FBP54 induce protective immune responses against Streptococcus pyogenes challenge in mice. Infect. Immun. 69 , 924–930 (2001). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Guzman, CA , Talay, SR , Molinari, G. , Medina, E. & Chhatwal, GS Protective immune response against Streptococcus pyogenes in mice after intranasal vaccination with the fibronectin-binding protein SfbI. J. Infect. Dis. 179 , 901–906 (1999). | PubMed | ISI | ChemPort |
Kuo, CF et al . Role of streptococcal pyrogenic exotoxin B in the mouse model of group A streptococcal infection. Infect. Immun. 66 , 3931–3935 (1998). | PubMed | ISI | ChemPort |
Roggiani, M. et al . Toxoids of streptococcal pyrogenic exotoxin A are protective in rabbit models of streptococcal toxic shock syndrome. Infect. Immun. 68 , 5011–5017 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lei, B. , Liu, M. , Chesney, GL & Musser, JM Identification of new candidate vaccine antigens made by Streptococcus pyogenes : purification and characterization of 16 putative extracellular lipoproteins. J. Infect. Dis. 189 , 79–89 (2004). | PubMed | ISI | ChemPort |
Cunningham, MW Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin. Microbiol. Rev. 13 , 470–511 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Cole, JN et al . Surface analyses and immune reactivities of major cell wall–associated proteins of group A Streptococcus . Infect. Immun. 73 , 3137–3146 (2005). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lancefield, RC Persistence of type-specific antibodies in man following infection with group A streptococci. J. Exp. Med. 110 , 271–292 (1959). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lancefield, RC Current knowledge of type-specific M antigens of group A Streptococci . J. Immunol. 89 , 307–313 (1962). | PubMed | ISI | ChemPort |
Hu, MC et al . Immunogenicity of a 26-valent group A streptococcal vaccine. Infect. Immun. 70 , 2171–2177 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Fernandez-Espla, MD , Garault, P. , Monnet, V. & Rul, F. Streptococcus thermophilus cell wall–anchored proteinase: release, purification, and biochemical and genetic characterization. Appl. Environ. Microbiol. 66 , 4772–4778 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Harris, TO , Shelver, DW , Bohnsack, JF & Rubens, CE A novel streptococcal surface protease promotes virulence, resistance to opsonophagocytosis, and cleavage of human fibrinogen. J. Clin. Invest. 111 , 61–70 (2003). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lei, B. , Mackie, S. , Lukomski, S. & Musser, JM Identification and immunogenicity of group A Streptococcus culture supernatant proteins. Infect. Immun. 68 , 6807–6818 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Top
Nature Biotechnology 24 , 191 - 197 (2006) Природа Биотехнология 24, 191 - 197 (2006)
Published online: 15 January 2006; | doi:10.1038/nbt1179 Опубликовано на сайте: 15 января 2006 года; | DOI: 10.1038/nbt1179
Characterization and identification of vaccine candidate proteins through analysis of the group A Streptococcus surface proteome Характеристика и определение вакцин кандидат белков на основе анализа группы Streptococcus поверхность ПРОТЕОМА
Manuel J Rodríguez-Ortega, Nathalie Norais, Giuliano Bensi, Sabrina Liberatori, Sabrina Capo, Marirosa Mora, Maria Scarselli, Francesco Doro, Germano Ferrari, Ignazio Garaguso, Tiziana Maggi, Anita Neumann, Alessia Covre, John L Telford & Guido Grandi Мануэля Родригеса J-Ортега, Натали Norais, Джулиано Bensi, Сабрина Liberatori, Сабрина Капо, Marirosa Мора, Мария Scarselli Франческо Доро, Germano Ferrari, Ignazio Garaguso, Тициана Maggi, Анита Неймана, Alessia Covre, Джон L Telford И Гвидо Grandi
Chiron Vaccines, Via Fiorentina, 1 53100 Siena, Italy. Хирон Вакцины, Виа Фиорентина, 1 53100 Сиена, Италия.
Correspondence should be addressed to Guido Grandi guido_grandi@chiron.com Корреспонденция должна быть адресованы Гвидо Grandi guido_grandi@chiron.com
We describe a proteomic approach for identifying bacterial surface-exposed proteins quickly and reliably for their use as vaccine candidates. Мы описываем протеомических подхода для выявления бактериальной поверхности подвергаются белки быстро и надежно для использования их в качестве вакцин. Whole cells are treated with proteases to selectively digest protruding proteins that are subsequently identified by mass spectrometry analysis of the released peptides. Всего клетки обрабатываются протеаз избирательно дайджест оттопыренными протеины, которые впоследствии определили масс-спектрометрии анализа пептидов освободили. When applied to the sequenced M1_SF370 group A Streptococcus strain, 68 PSORT-predicted surface-associated proteins were identified, including most of the protective antigens described in the literature. При применении к секвенированы M1_SF370 группы Streptococcus штамма, 68-PSORT предсказал поверхностных белков, связанных были выявлены, в том числе большинство защитных антигенов, описанных в литературе. The number of surface-exposed proteins varied from strain to strain, most likely as a consequence of different capsule content. Число поверхностных белков подвергаются разнообразным из штамма напрягаться, скорее всего, как следствие различных капсула содержание. The surface-exposed proteins of the highly virulent M23_DSM2071 strain included 17 proteins, 15 in common with M1_SF370. Поверхности подвергаются белки M23_DSM2071 высокой вирулентного штамма включала 17 белков, 15 совместно с M1_SF370. When 14 of the 17 proteins were expressed in E. Когда 14 из 17 белков, были высказаны в E. coli and tested in the mouse for their capacity to confer protection against a lethal dose of M23_DSM2071, one new protective antigen (Spy0416) was identified. коли и испытанные в мышь для их способность предоставлять защиту от смертоносных доз M23_DSM2071, один новый защитный антиген (Spy0416) были выявлены. This strategy overcomes the difficulties so far encountered in surface protein characterization and has great potential in vaccine discovery. Эта стратегия преодолевает трудности, до сих пор возникают в поверхностных протеинов квалификация и имеет огромный потенциал в вакцине открытий.
Bacterial surface proteins play a fundamental role in the interaction between the bacterial cell and its environment 1, 2, 3, 4, 5, 6 . Бактериальные поверхностные белки играют важную роль во взаимодействии между бактериальных клеток и окружающей среды 1, 2, 3, 4, 5, 6. They are involved in adhesion to and invasion of host cells, in sensing the chemical and physical conditions of the external milieu and sending appropriate signals to the cytoplasmic compartment, in mounting defenses against host responses and in toxicity. Они участвуют в адгезии и инвазии принимающих клеток, в зондирования химические и физические условия внешней среды и передача соответствующих сигналов к цитоплазматической отсека, в оборону против монтажа принимающей ответы и токсичности. Hence, surface proteins are potential targets of drugs aimed at preventing bacterial infections and diseases 7 . Таким образом, поверхностные белки являются потенциальными объектами препаратов, направленных на предупреждение бактериальных инфекций и заболеваний 7. Moreover, because surface proteins are likely to interact with the host immune system, they may become components of effective vaccines. Кроме того, поскольку поверхностные белки могут взаимодействовать с иммунной системой, они могут стать компонентами эффективных вакцин. Vaccines based on surface-exposed and secreted proteins are already commercially available and others are in development 8, 9 . Вакцины основывается на поверхности и подвергается секретированный белков уже коммерчески доступна, а другие находятся в процессе развития 8, 9.
Despite the biological relevance of bacterial surface proteins, their characterization is still incomplete. Несмотря на актуальность биологических бактериальных поверхностных белков, их характеристика по-прежнему неполными. This is mostly owing to difficulties in defining the protein composition and topology on the bacterial surface. Это в основном из-за трудностей в определении состава белка и топология на бактериальные поверхности. There are three main methods currently in practice to identify surface proteins. Существуют три основных метода в настоящее время на практике для выявления поверхностных белков. The first method is based on surface protein prediction by genome analysis using algorithms such as PSORT 10, 11 . Первый метод основан на поверхности белка прогнозирования путем анализа генома с помощью алгоритмов, таких, как PSORT 10, 11. The method is rapid but is not fully reliable and is not quantitative. Этот метод является быстрым, но не является полностью надежным, и не количественный характер. The second approach employs separation of membrane and cell wall fractions from the cytoplasmic fraction and then identification of proteins by two-dimensional (2D)-electrophoresis or 2D-chromatography coupled to mass spectrometry. Второй подход используется разделение мембраны и клеточной стенки от фракции цитоплазматической фракцию, а затем идентификации белков в двумерном (2D)-электрофорез или 2D-хроматографии в сочетании с масс-спектрометрии. This approach, which has been used in several bacteria 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , is reasonably quantitative. Этот подход, который был использован в некоторых бактерий, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, разумно количественный характер. However, it is not sufficiently selective and several cytoplasmic proteins contaminate the identified membrane proteins. Тем не менее, оно не является достаточно избирательно и несколько цитоплазматических белков контаминировать выявленных мембранных белков. Furthermore, neither of these first two approaches specifically identifies those proteins that actually extend beyond the cell wall and polysaccharide capsule into the extracellular milieu. Кроме того, ни один из этих двух подходов, конкретно определяются те белки, которые фактически выходят за пределы клеточной стенки и капсулы в полисахаридной внеклеточной среде. Finally, in the third approach, membrane proteins are first defined using one of the two methods described above and then surface localization is confirmed by producing polyclonal antibodies against the recombinant forms of each predicted protein and by assaying antibody binding to whole bacterial cells. Наконец, в третьем подходе, мембранные белки сначала определить с помощью одного из двух методов, описанных выше, а затем поверхность локализации подтверждается производству поликлональных антител против рекомбинантных форм каждого предсказал белка, а также анализ на антитела к обязательным всего бактериальных клеток. Although this method, recently used to identify vaccine candidates for group B Streptococcus 9 , is quantitative and does identify truly surface accessible proteins, it is extremely labor intensive. Хотя этот метод, в последнее время используется для идентификации вакцин для группы B Streptococcus 9, количественные и делает выявить действительно доступной поверхности белков, крайне трудоемким. Here we describe a new procedure that allows the rapid and selective identification of bacterial surface-exposed proteins, the pool of proteins which are entirely or partially exposed on the outside of bacterial cells. Здесь мы рассмотрим новую процедуру, которая позволяет быстро и селективного выявления бактериальной поверхности подвергаются белки, бассейн белков, которые полностью или частично выставлена на внешней поверхности бактериальной клетки. The method uses proteolytic enzymes to 'shave' the bacterial surface and the peptides generated are separated from the whole cells and identified by mass spectrometry. Этот метод использует протеолитических ферментов в 'брить' бактериальной поверхности и пептидов порожденных отделены от всего клеток и определили масс-спектрометрии. To demonstrate the power of the method, we present the characterization of the complete set of M1_SF370 group A Streptococcus (GAS) surface-exposed proteins. Для того, чтобы продемонстрировать силу этого метода, мы представляем характеризация комплект M1_SF370 группы Streptococcus (газа) на поверхности подвергаются белки. We show that 95% of the identified proteins belong to four protein families of predicted surface-associated proteins, most of which are accessible to polyclonal antibodies raised against the corresponding recombinant proteins. Мы показываем, что 95% из выявленных белков принадлежат четыре белковых семейств предсказал поверхности, связанных с белками, большинство из которых доступны поднятых поликлональных антител против рекомбинантных белков соответствует. We also show that the proteins identified include most of the protective antigens described in the literature and at least one new antigen capable of conferring consistent protection in the mouse against challenge with a virulent GAS strain. Мы также показали, что белки относятся большинство защитных антигенов, описанных в литературе, и по меньшей мере один новый антиген, способных присвоении последовательной защиты в борьбе с проблемой мышь с ГАЗ вирулентного штамма. Therefore, the approach represents a valuable tool to study surface protein organization and to identify new vaccine candidates. Таким образом, этот подход представляет собой ценный инструмент для изучения поверхности белка организации и в целях выявления новых вакцин-кандидатов.
Results Результаты
Analysis of M1_SF370 GAS strain Анализ M1_SF370 ГАЗ штамм
To identify the surface-exposed proteins of the completely sequenced M1_SF370 strain 19 , exponentially growing bacteria were collected and treated with either trypsin or proteinase K to shave the bacterial surface of exposed protein domains. Для выявления поверхностных подвергаются белки полностью секвенированы M1_SF370 штамма 19, экспоненциально растущей бактерии были собраны и лечение либо трипсин или протеиназы К бриться бактериальной поверхности облучаемой белка доменов. This treatment did not impair cell integrity as assessed by plating the bacteria before and after protease digestion (data not shown). Это лечение не нанести ущерб целостности клеток по оценке обшивки бактерий до и после протеазы пищеварения (данные не показаны). Peptides released into the supernatant were concentrated and analyzed by tandem mass spectrometry (MS/MS). Пептиды выпущено в супернатанта были сосредоточены и проанализированы тандем масс-спектрометрия (MS / MS). A total of 72 proteins were identified ( Fig. 1 and Supplementary Table 1 online): 37 from the matching of more than one peptide per protein, and 35 from single-peptide matching. В общей сложности из 72 протеинов было выявлено (рис. 1 и таблица 1 Дополнительная онлайн): 37 из сопоставления нескольких пептидных на белок, и 35 из одного пептида соответствия. Forty-three proteins were deduced from the trypsin-derived peptides, 18 proteins from the proteinase K–derived peptides and 11 proteins from both trypsin and proteinase K–derived peptides. Сорок три белки были выведены из-трипсин полученных пептидов, белков, 18 из протеиназы К-полученных пептидов и белков, 11 из трипсин и протеиназы К-полученных пептидов. From sequence analysis, the 72 proteins could be grouped into four major families: the cell wall–anchored family containing LPXTG-like motifs (12 proteins), the lipoprotein family (11 proteins), the transmembrane protein family (37 proteins) and the secreted-protein family (8 proteins). Из анализа последовательности, 72 белков могут быть сгруппированы в четыре основных семей: клеточной стенки-закрепленные семье, содержащей LPXTG-подобные мотивы (12 белков), липопротеина семьи (11 белков), трансмембранного белка семьи (37 белков), а секретированный -белка семьи (8 белков). Only four proteins predicted by PSORT to reside in the cytoplasmic compartment were found in the protease-sensitive fraction ( Supplementary Table 1 online). Только четыре белки предсказывают PSORT проживать в цитоплазматической отделении были обнаружены в протеазы учитывающие долю (дополнительные таблицы 1 в сети). They included the elongation factor Tu, reported to be membrane-associated in other bacteria 20, 21 , two ribosomal proteins, for which there is also evidence of extracellular functions 22, 23 , and a hypothetical protein possibly involved in cell wall localization and side-chain formation. Они включали в себя удлинение фактор Ту, по сообщениям, связанных с мембраной на других бактерий, 20, 21, два рибосомального белков, для которых есть доказательства внеклеточной функций 22, 23, и гипотетическими белка, возможно, участвуют в клеточной стенки локализации и побочные цепочке формирования.
Figure 1. The M1_SF370 surface proteome. Рисунок 1. M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА.
The 72 proteins belonging to the M1_SF370 surface proteome are grouped into families based on their predicted cellular location. 72 белков, входящих в M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА сгруппированы семей на основе их местоположения сотового предсказал. Red areas of each pie indicate the number of PSORT-predicted proteins that have not been found in the surface proteome, whereas the yellow areas represent the number of identified proteins belonging to each protein family. Красный районов каждого пирога указать количество PSORT предсказанных белков, которые не были обнаружены на поверхности ПРОТЕОМА, в то время как желтые районы представляют число выявленных белки, принадлежащие к каждой семье белка. The blue pies illustrate how many of the identified proteins have been confirmed to be surface-exposed by following antigen-specific antibody binding to whole bacterial cells using FACS analysis. Синий пироги показывают, как многие из указанных белков были подтверждены для поверхностного воздействия на следующий конкретный антиген-антитело обязательными для всего бактериальных клеток с помощью СУИМ анализа.
Full Figure and legend (59K) Полный Рисунок и легенда (59K)
Confirmation of protein surface exposure Подтверждение белка поверхности облучения
The almost complete absence of peptides from predicted cytoplasmic proteins suggested that the procedure was selective for the identification of surface-exposed proteins. Почти полное отсутствие пептидов из предсказал цитоплазматических белков высказано мнение, что процедура носит избирательный характер для выявления поверхностных подвергаются белки. To confirm this, we carried out two types of analysis. Чтобы подтвердить это, мы провели два вида анализа. First, we analyzed the 37 transmembrane proteins ( Supplementary Table 1 online) with PSORT topological prediction analysis and asked whether the MS/MS-identified peptides were located within domains predicted to be on the external side of the membrane. Во-первых, мы проанализировали 37 трансмембранный белки (Дополнительный Таблица 1 онлайн) с PSORT Топологический анализ и прогнозирование ли MS / MS-пептидов были определены расположенные в доменах прогнозам, будет на внешнюю сторону мембраны. For 26 out of 37 proteins experimental MS/MS data were consistent with PSORT predictions ( Fig. 2 ). Для 26 из 37 белков экспериментальной MS / MS данные согласуются с прогнозами PSORT (Рис. 2). In contrast, for the remaining 11 proteins, the identified peptides mapped either in domains predicted to be intracellular or, in two cases, embedded in the membrane. В отличие от этого, на оставшиеся 11 белков, пептидов определила карту либо в областях, по прогнозам, будет внутриклеточных или, в двух случаях, встроенных в мембраны. However, from manual inspection of the annotations, we came to the conclusion that the PSORT-predicted transmembrane organization of at least 6 out of 11 proteins ( Supplementary Table 1 online) should be revisited. Однако, начиная с руководства инспекции аннотации, мы пришли к выводу, что предсказал PSORT-трансмембранный организации, по крайней мере 6 из 11 белков (дополнительные таблицы 1 в сети), должны быть пересмотрены. In particular, the two peptides derived from the putative cell division protein Spy0015, homologous to the FtsH protein family, are located within a conserved protein domain known to be extracellular in FtsH proteins 24, 25, 26 . В частности, два пептиды, полученные от предполагаемого клеток белка Spy0015, гомологичен FtsH белкового семейства, находится в сохранение белка домена известно, внеклеточная в FtsH белков 24, 25, 26. The four peptides of Spy1520, a second putative cell division protein homologous to FtsZ, are located within the C-terminal part of the molecule, a region that in Bartonella bacilliformis is immunogenic and surface-exposed 27 . Четыре пептидов Spy1520, второй предполагаемый клеток белка FtsZ гомологичен, расположены в пределах С-терминал часть молекулы, что в регионе Bartonella bacilliformis это иммуногенность и поверхностных подвержены 27. The two hypothetical proteins Spy0351 and Spy2184 are likely to be lipoproteins rather than integral membrane proteins. Две гипотетические белки Spy0351 и Spy2184 могут липопротеидов, а не интегральных мембранных белков. In fact, their predicted transmembrane regions have a very poor PSORT score and therefore we expect them to completely extend out of the membrane. По сути, их предсказал трансмембранный регионы очень плохо PSORT баллов и поэтому мы надеемся, что они полностью продлить из мембраны. This is also supported by the presence, adjacent to their predicted leader-peptide cleavage sites, of the cysteine, which in lipoproteins is used as the anchor residue to the bacterial surface. Это также поддерживается за счет присутствия, прилегающих к их предсказал лидер-пептида спайности объектов, цистеин, которая в липопротеидов используется как якорь остатков на поверхности бактериальных. Spy1154 has two predicted transmembrane regions, the second of which has a very poor PSORT score (-0.32 as opposed to -8.12 of the first transmembrane region). Spy1154 два предсказал трансмембранный регионов, вторая из которых имеет очень плохие PSORT баллов (-0.32 по сравнению с -8,12 из первых трансмембранный обл.) If, as is likely, the prediction of the second transmembrane region were wrong, the C-terminal part of the molecule, which carries a typical sortase domain, would be exposed on the surface, which would be consistent with the mechanism of action of sortases 28 . Если, как это, вероятно, предсказание о втором трансмембранного региона были неправы, то C-терминал часть молекулы, которая несет в себе типичные sortase области, будет выставлена на поверхность, которая будет соответствовать механизм действия sortases 28. Finally, Spy0184, a putative glycine betaine binding–permease protein, is predicted to have six transmembrane regions, one of which has a poor score. Наконец, Spy0184, предполагаемый глицин betaine обязательного-permease белок, согласно прогнозам, иметь шесть трансмембранный регионов, один из которых имеет плохой балл. Again, if the weak transmembrane region were ignored, the topological organization would change and the C-terminal region, where the two MS/MS-identified peptides fall, would become surface-exposed. Опять же, если слабый трансмембранного региона были проигнорированы, Топологический организации изменится и С-концевой области, где два MS / MS-выявлены пептиды осенью, станет поверхности подвергаются. Indeed, polyclonal antibodies against the C-terminal domain of the protein efficiently bound GAS M1_SF370 whole cells when tested by fluorescence-activated cell sorting (FACS; data not shown). Действительно, поликлональные антитела против С-концевого домена из белка эффективно связаны ГАЗ M1_SF370 целом клеток при испытании на флуоресценцию активированных клеток сортировки (СУИМ; данные не показаны).
Figure 2. Topological analysis of the 37 surface-exposed proteins belonging to the membrane protein family. Рисунок 2. Топологические анализ 37 поверхностных белков подвергаются принадлежащие к мембране белкового семейства.
Each of the 37 membrane proteins belonging to the M1_SF370 surface proteome was subjected to PSORT topological prediction. Каждая из 37 мембранных белков, принадлежащих к M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА был подвергнут PSORT Топологический прогнозирования. ( a ) All proteins whose predicted topology is consistent with the experimental data are shown; the proteolytic peptides (shown in red in the figure) derived by protease treatment of whole cells are in fact located on domains protruding out of the membrane. () Все белки которого предсказал топологии согласуются с экспериментальными данными приведены; протеолитических пептидов (показан красным цветом на рисунке), полученных путем протеазы лечения целых клеток, по сути, расположенных на доменах выступающие из мембраны. ( b , c ) Shown are the 11 proteins showing discrepancies between in silico -predicted topology and experimental data (see text for details) and whose identification was deduced from the characterization of more than one ( b ) or one ( c ) peptide. (B, C) показано 11 белков с указанием различий между silico в предсказанным топологии и экспериментальные данные (см. текст в подробности) и идентификация которых была выведена из характеристик более чем одним (б), либо один (с) пептида.
Full Figure and legend (96K) Полный Рисунок и легенда (96K)
The second type of study was based on FACS analysis using protein-specific antibodies. Второй тип исследования была основана на анализе использования СУИМ белково-специфических антител. Mouse polyclonal antibodies were produced against 51 recombinant proteins selected from among the M1_SF370 surface-exposed proteins, and the antibodies were tested for their capacity to bind whole bacteria. Мыши поликлональные антитела были подготовлены в отношении 51 рекомбинантных белков, отобранных из числа M1_SF370 поверхности подвергаются белки и антитела были проверены на их способность связывать весь бактерий. All but seven sera were positive in the assay, confirming surface exposure of the proteins ( Fig. 1 and Supplementary Table 1 online). Все, кроме семи сыворотки были положительными в тесте, подтверждающий поверхностного воздействия на белки (рис. 1 и таблица 1 Дополнительная сети). For the remaining 21 proteins for which antisera were not available, we expect that a similar proportion would also be FACS positive. Для остальных 21 белков, для которых антисывороток не были представлены, мы ожидаем, что аналогичная доля будет также СУИМ положительным. Furthermore, several of the proteins appeared well expressed/exposed on the surface, as judged by fluorescent intensity, which, in some cases, was in the same range as that observed with the major surface antigen, the M protein 29 . Кроме того, некоторые белки, как хорошо выразил / выставлена на поверхность, а судить по флуоресцентной интенсивности, которая в некоторых случаях, в том же диапазоне, что и наблюдается с основными поверхности антиген, М протеин 29.
In conclusion, considering that (i) all proteins identified have a highly significant MASCOT score ( Supplementary Table 1 online), (ii) a large proportion of the 72 proteins is compatible with the corresponding PSORT-predicted localization and topology and (iii) a good match exists between the mass spectrometry data and the FACS data, we believe that the method leads to a reliable list of surface-exposed proteins. В заключение, учитывая, что (я) все выявленные белки имеют весьма важное значение MASCOT баллов (Таблица 1 Дополнительная онлайн), (II), значительная часть из 72 белков, совместимый с соответствующей PSORT-предсказал локализации и топологии и (III) хорошее соответствие между данными масс-спектрометрии и СУИМ данных, мы считаем, что этот метод приводит к надежным список поверхности подвергаются белки. Obviously, we cannot rule out that some of the identified proteins may represent experimental artifacts. Очевидно, что мы не можем исключать, что некоторые из указанных белков может представлять экспериментальные артефакты. In this respect, we have listed the proteins on the basis of the likelihood of being truly exposed on the surface ( Supplementary Table 2 online). В этой связи мы перечислили белки на основе вероятности быть действительно выставлена на поверхность (Дополнительный Таблица 2 сети). The highest probability score can be assigned to 52 proteins in that they were either confirmed by FACS analysis (44 proteins) or, despite the fact that FACS data were not available (5 proteins) or were negative (3 proteins), were identified with more than one peptide. Самая высокая оценка вероятности может быть назначено до 52 белков, в том, что они либо были подтверждены СУИМ анализ (44 белков), либо, несмотря на тот факт, что СУИМ данные не были доступны (5 белков), либо были отрицательными (3 белки), были выявлены более чем одного пептида.
Application to vaccine discovery Применительно к открытию вакцины
From our previous experience with Meningococcus B and group B Streptococcus we know that protective antigens must be well expressed and exposed on the surface of the bacterial cell 8, 9 . Из нашего предыдущего опыта менингококка группы B и B Streptococcus мы знаем, что защитные антигены должны быть четко выражена и воздействию на поверхности бактериальных клеток 8, 9. Hence, the comprehensive analysis of surface-exposed proteins may be an ideal approach to the identification of vaccine candidates. Таким образом, комплексный анализ поверхности подвергаются белки могут быть идеальный подход к выявлению вакцин. In support of this, 7 of the 11 reported GAS protective antigens 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 whose genes are present in M1_SF370 are part of the M1_SF370 surface proteome ( Table 1 ). В подтверждение этого, 7 из 11 сообщили, ГАЗ защитных антигенов, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, чьи гены присутствуют в M1_SF370 являются частью M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА ( Таблица 1). We therefore decided to investigate whether proteins identified here could elicit protective responses in a mouse model of infection and disease. Поэтому мы решили исследовать белки выявлены ли здесь можно было получить ответы на защитные мышь Модель инфекции и болезни. To this end, we analyzed the complete set of surface-exposed proteins of M23_DSM2071, a GAS strain that, unlike M1_SF370, is highly virulent in mice. С этой целью мы проанализировали комплект поверхности подвергаются белки M23_DSM2071, ГАЗ напряжения, что, в отличие от M1_SF370, очень вирулентного у мышей. It should be noted that, because the genome sequence of M23_DSM2071 is not available, only the proteins whose genes are shared with M1_SF370 or any of the other six GAS strains whose sequences are available in the public databases ( http://www.tigr.org/ and http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) could be identified. Следует отметить, что, поскольку геном последовательность M23_DSM2071 не имеется, только белки, гены, которые являются общими с M1_SF370 или любой из других шести ГАЗ штаммы которых последовательностей имеются в государственных базах данных (http://www.tigr. Org / и http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), могут быть идентифицированы. Furthermore, in contrast to M1_SF370, M23_DSM2071 produces a robust amount of capsule (data not shown), which is expected to limit the number of proteins readily accessible to protease action. Кроме того, в отличие от M1_SF370, M23_DSM2071 производит надежные размере капсулы (данные не показаны), который, как ожидается, ограничить количество белков, легко доступных для протеазы действий. A total of 17 proteins were unambiguously identified: 5 cell wall–anchored proteins, 4 lipoproteins, 5 membrane proteins, 2 secreted proteins and 1 cytoplasmic protein ( Table 2 ). В общей сложности из 17 белков были однозначно определены: 5-клеточной стенки закреплена белков, липопротеидов 4, 5 мембранные белки, протеины секретированный 2 и 1 цитоплазматической белка (табл. 2). All of the identified proteins have a homolog in M1_SF370 and all but two (the putative zinc-containing alcohol dehydrogenase and the putative, RofA-related, regulatory protein) were also included in the M1_SF370 surface proteome ( Supplementary Table 1 online). Все выявленные белки имеют homolog в M1_SF370 и все, за исключением двух (мнимых цинк-содержащих алкоголь дегидрогеназа и мнимых, RofA связаны регулирования белка), были также включены в M1_SF370 поверхности ПРОТЕОМА (дополнительные таблицы 1 в сети). Of the 17 proteins specific to M23_DSM2071, 14 proteins were successfully expressed in Escherichia coli as either soluble histidine-fusions or glutathione S -transferase (GST)-fusions ( Table 2 ). Из 17 белков, характерных для M23_DSM2071, 14 белков были успешно выразил в кишечной палочки в виде растворимых гистидин-слияний и глутатион S-трансферазы (GST)-слияний (Таблица 2). Each recombinant protein was used to immunize mice intraperitoneally and the mice were subsequently challenged intranasally with an LD 90 dose (10 6 colony forming units (CFUs) in 50 Каждый рекомбинантного белка была использована для иммунизации мышам внутрибрюшинно и мышами впоследствии были оспорены intranasally с доза ЛД 90 (10 6 колонии формирование подразделений (CFUs) в 50 l) of M23_DSM2071 (LD 90 is defined as the dose that kills 90% of the challenged mice). л) от M23_DSM2071 (LD 90 считается доза, которая убивает 90% оспорило мышей). Two proteins were protective in this model: the M protein (90% survival rate) and Spy0416 (70% survival rate) ( Table 3 ). Две защитные белки были в этой модели: М протеин (90% выживаемости) и Spy0416 (70% выживаемости) (Таблица 3). Spy0416 is a putative cell envelope proteinase carrying a typical cell wall–anchoring LPXTG motif, whose protective activity has never been reported before. Spy0416 является предполагаемый клеток конверт протеиназ перевозящие типичные клеточной стенки-якорь LPXTG мотив, чья защитная деятельность никогда не было сообщено ранее.
Table 1. List of reported group A Streptococcus protective antigens and their identification in the M1_SF370 surface proteome Таблица 1. Список зарегистрированных группы Streptococcus защитных антигенов и их идентификации в M1_SF370 поверхностных ПРОТЕОМА
Full Table Полная таблица
Table 2. Surface proteome of group A Streptococcus M23_DSM2071 strain and comparison with the M1_SF370 surface proteome Таблица 2. Поверхность ПРОТЕОМА группы Streptococcus M23_DSM2071 деформации и сравнение с M1_SF370 поверхность ПРОТЕОМА
Full Table Полная таблица
Table 3. Protective activity of Spy0416 Таблица 3. Защитные деятельности Spy0416
Full Table Полная таблица
Top Верх
Discussion Обсуждение
In silico analysis of the complete sequence of >100 bacterial genomes predicts that surface-associated proteins constitute between 30% and 40% of all bacterial proteins. В silico анализ полной последовательности> 100 бактериальных геномов, предсказывает, что поверхностно-ассоциированных белков составляют от 30% до 40% всех бактериальных белков. A considerable proportion of these proteins are poorly characterized in terms of function, level and kinetics of expression, and topology. Значительная часть этих белков плохо с точки зрения функций, уровня и кинетика выражения и топологии. Surface proteins of several bacteria have been analyzed using a variety of proteomic approaches. Поверхностные белки некоторых бактерий, были проанализированы с использованием разнообразных протеомических подходов. However, reliable methods capable of providing detailed pictures of surface protein organization in bacteria are still unavailable. Вместе с тем, надежных методов, способных оказать подробные фотографии поверхности белка организации бактерий по-прежнему недоступна. Particularly challenging has been the identification of the pools of proteins that extend beyond the cell wall and polysaccharide capsule and constitute a subgroup of membrane proteins that are expected to play key roles in communicating and interacting with the environment. Особенно сложным было определение бассейны белков, которые выходят за стены клеток и полисахаридов капсулы и представляют собой подгруппу мембранных белков, которые, как предполагается, играют ключевую роль в общении и взаимодействии с окружающей средой. Moreover, in pathogenic bacteria these proteins are the most promising vaccine candidates, as we also have recently demonstrated 8, 9 . Кроме того, патогенные бактерии, эти белки являются наиболее перспективных вакцин-кандидатов, а также недавно продемонстрировали 8, 9.
GAS is responsible for a variety of clinical syndromes, ranging from uncomplicated pharyngitis and impetigo to pneumonia, sepsis, necrotizing fasciitis and streptococcal toxic shock syndrome. ГАЗ отвечает за целый ряд клинических синдромов, от незатрудненного фарингита и импетиго на пневмонию, сепсис, некротический фасцит и стрептококковый синдрома токсического шока. Furthermore, untreated streptococcal pharyngitis and skin infections may lead to acute rheumatic fever, chronic rheumatic heart disease and acute glomerulonephritis 42 . Кроме того, неочищенные стрептококковый фарингит и кожные инфекции может привести к острой ревматической атаки, хронические ревматические болезни сердца и острый гломерулонефрит 42. Despite the importance of this pathogen, to the best of our knowledge, the systematic analysis of its surface antigens is limited to one publication 43 in which the authors analyzed mutanolysin cell wall extracts of three different GAS strains by a combination of 2D gel/mass spectrometry analysis and immunoblots with human sera. Несмотря на важность этого патогена, насколько нам известно, систематический анализ ее поверхностных антигенов ограничивается одной публикации 43, в которой авторы проанализировали mutanolysin клеточной стенки экстрактов трех различных штаммов ГАЗ на сочетание 2D гель / масс-спектрометрии анализ и immunoblots с человеческой сыворотки. The drawback of this approach is that digestion of the peptidoglycan cell wall increases susceptibility to lysis and release of cytoplasmic proteins. Недостаток такого подхода заключается в том, что пищеварение в peptidoglycan клеточной стенки увеличивается восприимчивость к лизис и высвобождение цитоплазматических белков. In fact, of the 74 proteins identified in these experiments, 75% were predicted to be cytoplasmic and less than 25% were experimentally demonstrated to be on the surface. В самом деле, из 74 протеинов, выявленных в этих экспериментах, 75% из них были по прогнозам, будет цитоплазматической и менее чем на 25% было экспериментально доказано, что на поверхности.
The approach described here provides the most extensive and detailed map of the surface-exposed antigens of a GAS isolate to date. Подход, описанный здесь, представляет собой наиболее обширную и подробную карту поверхности дозы антигена ГАЗ выделить на сегодняшний день. Of the 72 surface-exposed proteins identified in the M1_SF370 strain, 95% were predicted to belong to the categories of cell wall–anchored proteins, lipoproteins, transmembrane-spanning proteins and secreted proteins. Из 72 поверхностных белков подвергаются определенным в M1_SF370 деформации, 95% из них были прогнозам относятся к категории клеточной стенке закреплена-белков, липопротеидов, трансмембранный охватывающие белки и белки секретированный. Genome analysis predicts that the numbers of GAS M1_SF370 proteins constituting these protein families are 17, 28, 561 and 83, respectively ( Fig. 1 ). Геном анализ предсказывает, что число ГАЗ M1_SF370 этих белков, составляющих белка семей 17, 28, 561 и 83, соответственно (рис. 1). Therefore, although a large proportion of all predicted cell wall–anchored proteins and lipoproteins were identified (70% and 40%, respectively), only a small fraction (6.5%) of these were transmembrane proteins. Таким образом, хотя значительная доля всех предсказал-клеточной стенки закреплена белков и липопротеидов были выявлены (70% и 40% соответственно), лишь небольшая часть (6,5%) из них были трансмембранный белков. This indicates that the majority of these proteins are deeply embedded in the membrane and/or hidden by cell wall components, are poorly expressed or both. Это свидетельствует о том, что большинство из этих белков глубоко встроенных в мембраны и / или скрыты компоненты клеточной стенки, слабо выраженные или обоих. Although we cannot rule out that some membrane-associated proteins were not identified because they are either too resistant or too sensitive to protease digestion, we believe that the number of false-negative proteins is limited. Хотя мы не можем исключать, что некоторые мембранных белков, связанных не были определены, поскольку они являются либо слишком устойчивы или слишком чувствительны к протеазы пищеварение, мы считаем, что количество ложных отрицательных белков ограничено. First, most of the cell wall proteins and lipoproteins, which are designed to extend out of the membrane, were identified, whereas very few secreted proteins were identified; this is in keeping with the notion that only a minor fraction of secreted proteins remain associated with the bacteria. Во-первых, большая часть клеточной стенки белков и липопротеидов, которые призваны расширить из мембраны, были определены, в то время очень мало выделяется белков было выявлено, что в соответствии с тем, что лишь незначительная часть выделяется белки остаются связанными с бактерии. Second, no biochemical or structural reasons are known that make membrane proteins either more sensitive or more resistant to protease treatment than the cell wall proteins and lipoproteins are. Во-вторых, нет биохимических или структурных причин, как известно, что мембранные белки делать либо более чувствительны и более устойчивы к лечению, чем протеазы клеточной стенки белков и липопротеидов являются. Moreover, we have recently described the presence of pili in GAS and we have shown that pili correspond to the trypsin-resistant T antigens described by Lancefield and used for serotyping of GAS isolates 30 . Кроме того, мы недавно описал присутствие Пили в газе и мы показали, что Пили соответствуют трипсин устойчивостью T антигенов описывается Lancefield и используется для serotyping газа изолятах 30. Despite their trypsin-resistant nature, thanks to the use of more than one protease in the shaving step, the pilin proteins (NT01SP0102 and Spy0128) were part of the surface proteome ( Supplementary Table 1 online). Несмотря на их трипсин устойчивый характер, благодаря использованию более одного протеазы в бритвенный шаг, pilin белки (NT01SP0102 и Spy0128) были частью поверхности ПРОТЕОМА (Таблица 1 Дополнительные сети). Therefore, even the most recalcitrant proteins could be identified. Поэтому, даже самые непокорные белков могут быть выявлены.
Several membrane proteins are known to be shielded by other surface-exposed protein complexes and, in the case of capsulated bacteria, by the polysaccharide capsule that surrounds the bacterial cells. Несколько мембранных белков, как известно, экранированный другие поверхности подвергаются белковые комплексы, и, в случае capsulated бактерий путем полисахаридной капсула, которая окружает бактериальной клетки. In line with this, M23_DSM2071, a strain which produces more capsule than M1_SF370, was found to contain a relatively small number of surface-exposed proteins (17) compared to the 72 proteins of M1_SF370. В соответствии с этим, M23_DSM2071, штамм, который производит больше, чем капсулы M1_SF370, было установлено, содержат относительно небольшое количество поверхности подвергаются белки (17) по сравнению с 72 белков M1_SF370. Furthermore, we have recently found that M3_CDCSS-90, a highly virulent strain that, when grown in liquid culture, has three times as much capsular polysaccharide as M1_SF370 (data not shown), contained only ten major surface-exposed proteins ( Supplementary Table 3 online). Кроме того, недавно мы обнаружили, что M3_CDCSS-90, весьма вирулентных штаммов, что, когда выросли в жидкой культурой, имеет в три раза больше капсульные полисахаридной как M1_SF370 (данные не показаны), которые содержатся только в десяти крупных поверхности подвергаются белки (Дополнительный Таблица 3 сети). Although the genome sequences of both M3_CDCSS-90 and M23_DSM2071 are not available and therefore a few proteolytic peptides could not have been identified because of the sequence variation and gene variability within strains, overall our data indicate that the capsule plays a role in determining the extent of protein accessibility on the bacterial surface. Несмотря на то, что последовательность генома, так M3_CDCSS-90 и M23_DSM2071 не доступны, и поэтому несколько протеолитических пептидов не могли быть выявлены в результате вариаций последовательности генов и изменчивость в штаммы, в целом наши данные свидетельствуют о том, что капсула играет роль в определении степени белка доступность по бактериальной поверхности. This is consistent with what we have recently demonstrated for a group B Streptococcus protein, which was only accessible to antibody recognition in a capsule-negative mutant, and not in the parental wild-type encapsulated strain 9 . Это согласуется с тем, что мы недавно продемонстрировали в группе B Streptococcus белка, которая была доступна только на антитела к признанию в капсуле-негативного мутанта, а не на родителей дикого штамма инкапсулированные 9.
An important aspect of the approach proposed here is its utility in refining the protein topology derived from computer-assisted predictors such as PSORT. Важным аспектом предлагаемого подхода заключается в его полезность уточнения топологии белка, полученных из компьютера с помощью предсказателей, таких, как PSORT. Because the procedure selectively identifies peptides proteolytically generated from surface-exposed domains, by matching the topology prediction with peptide data, one can either confirm or refine the membrane organization of each identified protein. Поскольку процедура избирательно определяются пептидов proteolytically полученные от поверхности подвергаются областях, в соответствие с топологией прогнозирования пептид данные можно либо подтвердить или уточнить мембраны организации каждому из выявленных белка. In general, we found a good correlation between theoretical and experimental data. В общем, мы нашли хорошую корреляцию между теоретическими и экспериментальными данными. However, the topology of 30% of the transmembrane proteins identified did not fit with peptide data. Вместе с топологией 30% белков трансмембранный определил не соответствуют пептид данных. Manual inspection of each transmembrane protein highlighted the difficulty that algorithms such as PSORT encounter in assigning topological organization of proteins carrying transmembrane regions with low probability scores. Ручная проверка каждой трансмембранного белка подчеркнул, что сложность алгоритмов, таких, как PSORT столкнуться в присвоении Топологический организации белков, перевозящих трансмембранный регионах с низкой вероятностью очков. In this respect, the procedure could be successfully used in future refinements of current algorithms. В связи с этим процедуры могут быть успешно использованы в будущем уточнений существующих алгоритмов.
The search for effective vaccines to prevent group A streptococcal infections has been ongoing for many decades. Поиск эффективных вакцин для предотвращения стрептококкового группу инфекций была постоянной в течение многих десятилетий. Based on the original observation by Lancefield 44 that protection against GAS correlates in humans with the levels of bactericidal antibodies, the search for vaccine candidates has been focused on surface antigens. Основываясь на оригинальной замечание Lancefield 44 о том, что защита от ГАЗ соотносится у людей с уровнем антител бактерицидно, поиски вакцины кандидатов была сосредоточена на поверхности антигены. Indeed, the most promising vaccine candidate so far described is the surface M protein, which is a primary virulence determinant and which is used for GAS serotyping 45 . Действительно, наиболее перспективным кандидатом вакцины до сих пор описанных является поверхности М протеин, который является одним из основных факторов, определяющих вирулентность, и который используется для ГАЗ serotyping 45. However, the M protein is a highly variable antigen such that GAS is currently classified in more than 100 different serotypes. Тем не менее, М белка высоко переменная антиген таким образом, чтобы газ в настоящее время классифицируются в более чем 100 различных серотипов. Therefore, although vaccine studies based on M protein are well underway 2, 46 , the identification of other, more conserved protective surface antigens would be highly desirable. Поэтому, хотя исследования вакцин основано на М белка хорошо по 2, 46, выявление других, более сохранение защитных поверхностных антигенов бы весьма желательным. A relevant result from our work is the demonstration that comprehensive characterization of surface-exposed proteins can lead to new vaccine candidate discovery. Соответствующим результатом нашей работы является демонстрацией, что всесторонняя характеристика поверхности подвергаются белки могут привести к новой вакцине кандидата открытий. Among the 14 identified surface proteins tested, one protein, Spy0416, conferred high protection levels. Из 14 выявленных поверхностных белков испытания, один белок, Spy0416, присудил высокие уровни защиты. This is a remarkable result, considering the paucity of protective antigens that have been identified to date. Это замечательный результат, учитывая скудость защитных антигенов, которые были определены на сегодняшний день. Spy0416 is a 1,647 amino acid cell wall protein, which shares 48% similarity with the C5a peptidase precursor and has a calcium-dependent serine protease activity 47 . Spy0416 является 1647 аминокислот белка клеточной стенки, которая разделяет 48% сходства с C5a peptidase прекурсоров и кальций-зависимых протеаз серин деятельности 47. Spy0416 has a homolog in group B Streptococcus (cspA) that was proposed to be involved in virulence by potentially protecting the bacterium from opsonophagocytic killing 48 . Spy0416 имеет homolog в группе B Streptococcus (cspA), что было предложено принять участие в вирулентности потенциально защитить бактерии от opsonophagocytic убив 48. Interestingly, Lei and coworkers recently found that a 31-kDa, N-terminal fragment of Spy0416 is released in the supernatant of GAS cultures and that the protein is well recognized by sera from GAS-infected patients 49 . Интересно, лей и коллегами недавно обнаружил, что 31-кДа, N-концевой фрагмент Spy0416 выпущена в супернатант ГАЗ культуры и что белков хорошо признана сывороток от ГАЗ-инфицированных пациентов, 49. Based on the seven available genome sequences, the protein appears to be highly conserved (over 98% identity) and preliminary data on surface expression on a panel of 20 different GAS strains indicate that Spy0416 is a major component of over 70% of circulating strains (SC and GB, unpublished data). Исходя из семи имеющихся последовательностей генома, белково-видимому, сохраняется высокой (свыше 98% личности), и предварительные данные о поверхности выражение Группа ГАЗ 20 различных штаммов Spy0416 указывают на то, что является важным компонентом более 70% циркулирующих штаммов ( SC и ГБ, неопубликованные данные).
Top Верх
Methods Методы
Bacterial surface digestion. Бактериальные поверхности пищеварение.
Streptococcus pyogenes M1_SF370, M3_CDCSS-90 and M23_DSM2071 (DSMZ) were grown in Todd-Hewitt broth (THB) at 37 °C and 5% CO 2 , until an OD 600 of 0.4 (exponential phase) was reached. Streptococcus pyogenes M1_SF370, M3_CDCSS-90 и M23_DSM2071 (DSMZ) были выращены в Тодд-хьюиттовские бульоне (THB) при 37 ° С и 5% CO 2, до тех пор, пока ОД 600 0.4 (экспоненциальной фазе) была достигнута. Bacteria were harvested by centrifugation at 3,500 g for 10 min at 4 °C, and washed three times with PBS. Бактерии были заготавливаемым путем центрифугирования в 3500 г в течение 10 мин при 4 ° C, и три раза промывают с PBS. Cells were resuspended in one-hundredth volume of PBS containing 40% sucrose (pH 7.4 for trypsin digestion and pH 6.0 for proteinase K digestion). Клетки были resuspended в одной сотой объема PBS, содержащий 40% сахарозы (рН 7.4 для трипсин пищеварение и рН 6.0 для протеиназы К пищеварения). Digestions were carried out with 20 Digestions были проведены с 20 g trypsin (Promega) or 5 г трипсина (Promega) или 5 g proteinase K (Sigma) in the presence of 5 mM DTT, for 30 min at 37 °C. г протеиназы К (Sigma), в присутствии 5 мМ DTT, в течение 30 мин при 37 ° C. The digestion mixtures were centrifuged at 3,500 g for 10 min at 4 °C, and the supernatants (containing the peptides) were filtered using 0.22- Сбраживание смеси центрифугировали в 3500 г в течение 10 мин при 4 ° C, и supernatants (содержащий пептиды) были отфильтрованы с помощью 0.22 - m pore-size filters (Millipore) . м поровое размер фильтров (Millipore). Protease reactions were stopped with formic acid at 0.1% final concentration. Протеазы реакции были остановлены с муравьиной кислоты на 0,1% окончательный концентрации. Before analysis, salts were removed by off-line high-performance liquid chromatography (HPLC), with a 7-min gradient of 2–80% acetonitrile in 0.1% formic acid. Перед анализом, соли были удалены оффлайн высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), с 7-мин градиентом 2-80% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоты. Peptide fractions were concentrated with a Speed-vac centrifuge (Savant) , and kept at -20 °C until further analysis. Пептидов фракции были сконцентрированы с Speed-VAC центрифуг (Savant), и хранится при температуре -20 ° C до дальнейшего анализа.
Protein identification technology by nano-LC/MS/MS. Белки определение технологии nano-LC/MS/MS.
Two different platforms were used for the chromatographic separation of peptides and further identification by tandem mass spectrometry (MS/MS). Два разных платформах используются для хроматографического разделения пептидов и дальнейшее выявление тандем масс-спектрометрия (MS / MS). In the first, peptides were separated by 2-D-nano-liquid chromatography (LC; Dionex). Во-первых, пептиды были разделены на 2-D-нано-жидкостной хроматографии (LC; Dionex). In the first dimension, peptides were loaded on a strong cation exchange (SCX) column (10 cm В первом измерении, пептиды были погружены на сильные катионообменной (SCX) колонки (10 см 320 320 m inner diameter (id), packed with cross-linked particles functionalized with sulfoethyl groups) and eluted isocratically by applying five NaCl solutions of increasing concentrations (0.01, 0.05, 0.1, 0.5 and 1 M). м внутренний диаметр (ID), упакованные в сшитых частиц функционализированных с sulfoethyl групп) и eluted isocratically путем применения пяти NaCl решений увеличения концентрации (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 и 1 м). In the second dimension, peptides were separated by a reversed-phase C18 analytical column (15 cm Во второй аспект, пептиды были разделены вспять этапа C18 аналитические колонки (15 см 75 75 m id, C18 PepMap100, 3 м ID, C18 PepMap100, 3 m, 100 Å) through a C18 trap column (PepMap C18 м, 100 а) C18 ловушку колонка (PepMap C18 -precolumn, 300 -precolumn, 300 m id м ID 1 mm). 1 мм). Peptides were eluted with a 45-min gradient of 5–50% of 80% acetonitrile in 0.1% formic acid at a flow rate of 300 nl/min. Пептиды были eluted с 45-минутной градиентом 5-50% до 80% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоты на скорость потока 300 NL / мин. Eluates were continuously spotted onto an Anchor-Chip matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) target (Bruker Daltoniks), prepared with a thin layer of a saturated solution of Eluates постоянно заметили на Якорь Чип-матрицы с помощью лазерной десорбции ионизации (MALDI) целевая (Bruker Daltoniks), подготовленный с тонким слоем насыщенного решения -cyano-4-hydroxycynnamic acid in acetone, every 60 s using a Proteineer FC robot (Bruker Daltoniks). -циано-4-hydroxycynnamic кислоты в ацетоне, каждые 60 сек, используя Proteineer ФК робот (Bruker Daltoniks). After fraction collection, every spot was manually recrystallized with 0.6 После фракция коллекции, каждые месте был вручную recrystallized с 0,6 l of ethanol/acetone/0.1% trifluoroacetic acid (6:3:1). л ethanol/acetone/0.1% трифторуксусной кислоты (6:3:1). Mass spectrometry analysis was performed automatically with an Ultraflex MALDI-time-of-flight (TOF) instrument, under the control of the WARP LC software, version 1.0 (Bruker Daltoniks). Масс-спектрометрия анализ производится автоматически при Ultraflex MALDI-время-от-рейс (TOF) документа, под контролем WARP LC программного обеспечения, версия 1.0 (Bruker Daltoniks). First, MS spectra of all the spotted fractions were acquired for peak selection over the m/z range of 900–4,000, after which MS/MS spectra of selected peaks were obtained. Во-первых, MS спектры всех пятнистых фракций были приобретены на пик отбора более м / Z диапазоне 900-4000, после чего MS / MS спектры отдельных пиков были получены. After spectra acquisition, the individual MS/MS spectra acquired for each of the precursor ions were combined, smoothed and centroided using FlexAnalysis software, version 2.4 (Bruker Daltoniks), and then transferred to BioTools software, version 3.0 (Bruker Daltoniks) to create a batch .xml file containing the peak lists of any of the individual MS/MS spectra. После приобретения спектров, индивидуальный MS / MS спектрам приобрел для каждого из прекурсоров ионов были объединены, и сглаженный centroided использованием FlexAnalysis программного обеспечения, версия 2.4 (Bruker Daltoniks), а затем перевели в BioTools программного обеспечения, версия 3.0 (Bruker Daltoniks), чтобы создать партии. XML-файл, содержащий пик списках какой-либо из отдельных MS / MS-спектров. Search and identification of peptides were performed in batch mode with a licensed version of MASCOT, in a local database containing the 1,819 proteins derived from the complete genome sequences of S. Поиск и идентификация пептидов были выполнены в пакетном режиме с лицензированной версии MASCOT, в локальной базе данных, содержащей 1819 белков, полученных от полной последовательности генома С. pyogenes (downloaded from http://www.tigr.org/ and http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ). pyogenes (скачать с http://www.tigr.org/ и http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The MASCOT search parameters were (i) species, S. MASCOT поиска параметров (I) видов, С. pyogenes strain SF370; (ii) allowed number of missed cleavages (only for trypsin digestion), 6; (iii) variable post-translational modifications, methionine oxidation; (iv) peptide tolerance, pyogenes штамма SF370; (II) позволили число пропущенных раскол (только для трипсин пищеварение), 6 (III) переменной пост-трансляционной модификации, метионин окисления (IV) пептид терпимости, 100 ppm; (v) MS/MS tolerance, 100 частей на миллион; (V), MS / MS терпимости, 0.75 Da and (vi) peptide charge, +1. 0,75 Да и (VI) пептид заряд, 1. Only significant hits as defined by MASCOT probability analysis were considered. Единственное существенное хиты, как это определено MASCOT вероятность анализа были рассмотрены. The score thresholds for acceptance of protein identifications from at least one peptide were set by MASCOT as 18 for trypsin digestion and 36 for proteinase K digestion. Оценка пороговых уровней для принятия идентификации белка по крайней мере одного пептида были установлены в качестве MASCOT 18 трипсин пищеварение и 36 для протеиназы К пищеварение.
In the second platform, peptides were separated by nano-LC on a CapLC HPLC system (Waters) connected to a Q-ToF Micro Electron Spray Ionization (ESI) mass spectrometer equipped with a nanospray source (Waters). Во второй платформы, пептиды были разделены нано-LC на CapLC ВЭЖХ системы (Вода), подключенной к Q-TOF Micro Electron Брызгатель ионизации (ESI) масс-спектрометр, оснащенных nanospray источников (воды). Samples were loaded onto an Atlantis C18 NanoEase column (100 Пробы были погружены на Атлантис C18 NanoEase колонке (100 m id м ID 100 mm, Waters), through a C18 trap column (300 100 мм, воды), через C18 ловушка колонке (300 m id м ID 5 mm, Dionex). 5 мм, Dionex). Peptides were eluted with a 50-min gradient of 2–60% of 95% acetonitrile, in a solution of 0.1% formic acid at a flow rate of 400 nl/min. Пептиды были eluted с 50-минутной градиентом 2-60% от 95% ацетонитрила в растворе 0,1% муравьиной кислоты на скорость потока 400 NL / мин. The eluted peptides were subjected to an automated data-dependent acquisition program, using the MassLynx software , version 4.0 (Waters), where a MS survey scan was used to automatically select multicharged peptides over the m/z range of 400–2,000 for further MS/MS fragmentation. Eluted пептиды подвергаются автоматизированной данные, зависящие от приобретения программу, используя программное обеспечение MassLynx, версия 4.0 (Вода), в которых MS опроса сканирования используется для автоматического выбора многозарядный пептиды более м / Z диапазоне 400-2000 для дальнейшего MS / MS фрагментации. Up to three different components were subjected to MS/MS fragmentation at the same time. До трех различных компонентов, подвергались MS / MS фрагментации в то же время. For all the samples, a second nano-LC-MS/MS analysis was carried out for the selective fragmentation of mono-charged peptide species. Для всех образцов, второй nano-LC-MS/MS Анализ проводился на выборочной фрагментации моно-пептида заряженных видов. After data acquisition, the individual MS/MS spectra were combined, smoothed and centroided by MassLynx. После получения данных, отдельные MS / MS спектры были объединены, и сглаженный centroided по MassLynx. Search and identification of peptides were performed in batch mode with a licensed version of MASCOT, in a local database (see above), after converting the acquired MS/MS spectra in .pkl file. Поиск и идентификация пептидов были выполнены в пакетном режиме с лицензированной версии MASCOT в локальной базе данных (см. выше), после преобразования приобрели MS / MS спектров. PKL файл. The MASCOT search parameters were (i) species, S. MASCOT поиска параметров (I) видов, С. pyogenes genome sequences; (ii) allowed number of missed cleavages (only for trypsin digestion), 6; (iii) variable post-translational modifications, methionine oxidation; (iv) peptide tolerance, 500 ppm; (v) MS/MS tolerance, 0.3 Da and (vi) peptide charge, from +1 to +4. As for the previous platform, only significant hits as defined by MASCOT probability analysis were considered. The score thresholds for acceptance of protein identifications from at least one peptide were set by MASCOT as 18 for trypsin digestion and 36 for proteinase K digestion.
Expression and purification of GAS proteins and preparation of immune sera.
Cloning, expression and purification of recombinant proteins, and preparation of immune sera, were performed as described 9 . Briefly, the chromosomal DNA of M1_SF370 was used for gene amplification. PCR primers were designed so as to amplify genes without predicted signal-peptide coding sequences. PCR products were introduced into plasmid expression vectors so as to generate recombinant proteins fused either with 6-His or glutathione GST. His-tagged proteins were obtained by cloning in pET21b+ vectors (Novagen). E. coli BL21DE3 cells (Novagen) were used as the recipient. GST fusions were obtained by using pGEX-NN plasmids and E. coli BL21SI (Novagen) as the recipient. Affinity-purified proteins (three doses of 20 g/dose) were used to immunize groups of adult CD1 mice (six mice per group). Mice were bled 2 weeks after the third immunization. The sera of each group were pooled and stored at -80 °C.
Capsule quantification by colorimetric assay.
GAS strains were grown in 10 ml of THB and when the cultures reached an OD 600 of 0.4, cells were collected by centrifugation, washed twice with PBS and resuspended in 0.5 ml H 2 O. Hyaluronic acid polysaccharide was extracted twice by adding an equal volume of chloroform, and the organic phase was collected by centrifugation. For hyaluronic acid determination, 100 l of properly diluted organic phase were added to 1.9 ml of a solution containing 0.2% (wt/vol) Stains All Reagent (Sigma), 0.6% acetic acid and 50% formamide, and absorbance was measured at 640 nm and compared with the standard curve of hyaluronic acid experimentally defined using known amounts of polysaccharide.
FACS analysis of surface proteins.
Bacteria were grown in THB to an OD 600 of 0.4, washed twice with PBS, suspended in newborn calf serum ( NCS , Sigma), incubated for 20 min at 23 °C and dispensed into a 96-well (20 l/well). Eighty l of preimmune or immune mouse sera, diluted in PBS containing 0.1% BSA, was added to the bacterial suspension to a final dilution of 1:200 and incubated on ice for 30 min. After washing twice with 0.1% BSA in PBS, bacteria were incubated on ice for 30 min in 10 l of goat anti-mouse IgG , F(ab') 2 fragment-specific-R-phycoerythrin-conjugated (Jackson Immunoresearch Laboratories) diluted 100-fold in PBS containing 0.1% BSA, 20% NCS. After incubation, bacteria were washed with PBS/0.1% BSA, suspended in 200 l PBS and analyzed using a FACS Calibur cytometer (Becton Dickinson) and Cell Quest Software (Becton Dickinson) .
Screening of protective antigens in the mouse model.
Five-week-old female CD1 mice (ten mice/group) were immunized with 20 g of recombinant proteins administered intraperitoneally at 0, 21 and 35 d with complete Freund adjuvant (priming dose) and incomplete Freund adjuvant (booster doses). Blood samples were collected before the first and after the third immunizations. Immunized mice were challenged intranasally with 50 l of THB containing 10 6 CFUs of M23_DSM 2071 strain grown in THB broth at an OD 600 of 0.4. CFU number of the infecting dose was verified by plating on 5 TH plates supplemented with 0.5% yeast extract and 5% defibrinated sheep blood. After challenge, mice were controlled daily for survival and the final survival rate was calculated 10 d thereafter.
Note: Supplementary information is available on the Nature Biotechnology website .
Top
Received 10 August 2005; Accepted 18 November 2005; Published online: 15 January 2006.
REFERENCES
Lindahl, G. , Stalhammar-Carlemalm, M. & Areschoug, T. Surface proteins of Streptococcus agalactiae and related proteins in other bacterial pathogens. Clin. Microbiol. Rev. 18 , 102–127 (2005). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Courtney, HS , Dale, JB & Hasty, DL in Handbook of Bacterial Adhesion: Principles, Methods and Applications (eds. An, YN & Friedman, RJ) 553–579 (Human Press, Totowa, NJ, 2002).
Lin, J. , Huang, S. & Zhang, Q. Outer membrane proteins: key players for bacterial adaptation in host niches. Microbes Infect. 4 , 325–331 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Niemann, HH , Schubert, WD & Heinz, DW Adhesins and invasins of pathogenic bacteria: a structural view. Microbes Infect. 6 , 101–112 (2004). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Ton-That, H. , Marraffini, LA & Schneewind, O. Protein sorting to the cell wall envelope of Gram-positive bacteria. Biochim. Biophys. Acta 1694 , 269–278 (2004). | PubMed | ISI | ChemPort |
Janulczyk, R. & Rasmussen, M. Improved pattern for genome-based screening identifies novel cell wall–attached proteins in gram-positive bacteria. Infect. Immun. 69 , 4019–4026 (2001). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Galperin, MY & Koonin, EV Searching for drug targets in microbial genomes. Curr. Opin. Biotechnol. 10 , 571–578 (1999). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Pizza, M. et al . Identification of vaccine candidates against serogroup B meningococcus by whole-genome sequencing. Science 287 , 1816–1820 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Maione, D. et al . Identification of a universal group B Streptococcus vaccine by multiple genome screen. Science 309 , 148–150 (2005). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Nakai, K. Protein sorting signals and prediction of subcellular localization. Adv. Protein Chem. 54 , 277–344 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Doytchinova, IA , Taylor, P. & Flower, DR Proteomics in vaccinology and immunobiology: an informatics perspective of the immunone. J. Biomed. Biotechnol. 2003 , 267–290 (2003). | PubMed |
Molloy, MP et al . Proteomic analysis of the Escherichia coli outer membrane. Eur. J. Biochem. 267 , 2871–2881 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Phadke, ND et al . Analysis of the outer membrane proteome of Caulobacter crescentus by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics 1 , 705–720 (2001). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Molloy, MP et al . Profiling the alkaline membrane proteome of Caulobacter crescentus with two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics 2 , 899–910 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Nouwens, AS et al . Complementing genomics with proteomics: the membrane subproteome of Pseudomonas aeruginosa PAO1. Electrophoresis 21 , 3797–3809 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Rhomberg, TA et al . Proteomic analysis of the sarcosine-insoluble outer membrane fraction of the bacterial pathogen Bartonella henselae . Proteomics 4 , 3021–3033 (2004). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Sabarth, N. et al . Identification of surface proteins of Helicobacter pylori by selective biotinylation, affinity purification, and two-dimensional gel electrophoresis. J. Biol. Chem. 277 , 27896–27902 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Guina, T. et al . Proteomic analysis of Pseudomonas aeruginosa grown under magnesium limitation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14 , 742–751 (2003). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Ferretti, JJ et al . Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes . Proc. Natl Acad. Sci. USA 98 , 4658–4663 (2001). | Article | PubMed | ChemPort |
Marques, MA , Chitale, S. , Brennan, PJ & Pessolani, MC Mapping and identification of the major cell wall-associated components of Mycobacterium leprae . Infect. Immun. 66 , 2625–2631 (1998). | PubMed | ISI | ChemPort |
Dallo, SF , Kannan, TR , Blaylock, MW & Baseman, JB Elongation factor Tu and E1 beta subunit of pyruvate dehydrogenase complex act as fibronectin binding proteins in Mycoplasma pneumoniae . Mol. Microbiol. 46 , 1041–1051 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Spence, JM & Clark, VL Role of ribosomal protein L12 in gonococcal invasion of Hec1B cells. Infect. Immun. 68 , 5002–5010 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Kurar, E. & Splitter, GA Nucleic acid vaccination of Brucella abortus ribosomal L7/L12 gene elicits immune response. Vaccine 15 , 1851–1857 (1997). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Tomoyasu, T. et al . Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli . J. Bacteriol. 175 , 1352–1357 (1993). | PubMed | ISI | ChemPort |
Akiyama, Y. , Kihara, A. , Mori, H. , Ogura, T. & Ito, K. Roles of the periplasmic domain of Escherichia coli FtsH (HflB) in protein interactions and activity modulation. J. Biol. Chem. 273 , 22326–22333 (1998). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Amara, RR , Shanti, S. & Satchidanandam, V. Characterization of novel immunodominant antigens of Mycobacterium tuberculosis . Microbiology 144 , 1197–1203 (1998). | PubMed | ISI | ChemPort |
Padmalayam, I. , Anderson, B. , Kron, M. , Kelly, T. & Baumstark, B. The 75-kilodalton antigen of Bartonella bacilliformis is a structural homolog of the cell division protein FtsZ. J. Bacteriol. 179 , 4545–4552 (1997). | PubMed | ISI | ChemPort |
Paterson, GK & Mitchell, TJ The biology of Gram-positive sortase enzymes. Trends Microbiol. 12 , 89–95 (2004). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lancefield, RC Studies on the antigenic composition of group A hemolytic Streptococci . J. Exp. Med. 78 , 465–476 (1943). | Article | ChemPort |
Mora, M. et al . Group A Streptococcus produce pilus-like structures containing protective antigens and Lancefield T antigens. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102 , 15641–15646 (2005). | Article | PubMed | ChemPort |
Stalhammar-Carlemalm, M. , Areschoug, T. , Larsson, C. & Lindahl, G. The R28 protein of Streptococcus pyogenes is related to several group B streptococcal surface proteins, confers protective immunity and promotes binding to human epithelial cells. Mol. Microbiol. 33 , 208–219 (1999). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Reid, SD et al . Postgenomic analysis of four novel antigens of group A Streptococcus : growth phase-dependent gene transcription and human serologic response. J. Bacteriol. 184 , 6316–6324 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
McMillan, DJ et al . Identification and assessment of new vaccine candidates for group A streptococcal infections. Vaccine 22 , 2783–2790 (2004). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Ji, Y. , Carlson, B. , Kondagunta, A. & Cleary, PP Intranasal immunization with C5a peptidase prevents nasopharyngeal colonization of mice by the group A Streptococcus . Infect. Immun. 65 , 2080–2087 (1997). | PubMed | ISI | ChemPort |
Massell, BF , Michael, JG , Amezcua, J. & Siner, M. Secondary and apparent primary antibody responses after group A streptococcal vaccination of 21 children. Appl. Microbiol. 16 , 509–518 (1968). | PubMed | ISI | ChemPort |
Dale, JB , Chiang, EY , Liu, S. , Courtney, HS & Hasty, DL New protective antigen of group A Streptococci . J. Clin. Invest. 103 , 1261–1268 (1999). | PubMed | ISI | ChemPort |
Kawabata, S. et al . Systemic and mucosal immunizations with fibronectin-binding protein FBP54 induce protective immune responses against Streptococcus pyogenes challenge in mice. Infect. Immun. 69 , 924–930 (2001). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Guzman, CA , Talay, SR , Molinari, G. , Medina, E. & Chhatwal, GS Protective immune response against Streptococcus pyogenes in mice after intranasal vaccination with the fibronectin-binding protein SfbI. J. Infect. Dis. 179 , 901–906 (1999). | PubMed | ISI | ChemPort |
Kuo, CF et al . Role of streptococcal pyrogenic exotoxin B in the mouse model of group A streptococcal infection. Infect. Immun. 66 , 3931–3935 (1998). | PubMed | ISI | ChemPort |
Roggiani, M. et al . Toxoids of streptococcal pyrogenic exotoxin A are protective in rabbit models of streptococcal toxic shock syndrome. Infect. Immun. 68 , 5011–5017 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lei, B. , Liu, M. , Chesney, GL & Musser, JM Identification of new candidate vaccine antigens made by Streptococcus pyogenes : purification and characterization of 16 putative extracellular lipoproteins. J. Infect. Dis. 189 , 79–89 (2004). | PubMed | ISI | ChemPort |
Cunningham, MW Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin. Microbiol. Rev. 13 , 470–511 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Cole, JN et al . Surface analyses and immune reactivities of major cell wall–associated proteins of group A Streptococcus . Infect. Immun. 73 , 3137–3146 (2005). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lancefield, RC Persistence of type-specific antibodies in man following infection with group A streptococci. J. Exp. Med. 110 , 271–292 (1959). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lancefield, RC Current knowledge of type-specific M antigens of group A Streptococci . J. Immunol. 89 , 307–313 (1962). | PubMed | ISI | ChemPort |
Hu, MC et al . Immunogenicity of a 26-valent group A streptococcal vaccine. Infect. Immun. 70 , 2171–2177 (2002). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Fernandez-Espla, MD , Garault, P. , Monnet, V. & Rul, F. Streptococcus thermophilus cell wall–anchored proteinase: release, purification, and biochemical and genetic characterization. Appl. Environ. Microbiol. 66 , 4772–4778 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Harris, TO , Shelver, DW , Bohnsack, JF & Rubens, CE A novel streptococcal surface protease promotes virulence, resistance to opsonophagocytosis, and cleavage of human fibrinogen. J. Clin. Invest. 111 , 61–70 (2003). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Lei, B. , Mackie, S. , Lukomski, S. & Musser, JM Identification and immunogenicity of group A Streptococcus culture supernatant proteins. Infect. Immun. 68 , 6807–6818 (2000). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
Top
Subscribe to:
Posts (Atom)