Рак поджелудочной железы
Сахарный регрессия рака intratumoural инъекций жить Streptococcus pyogenes В сингенных модель мыши
С Maletzki1,
М Linnebacher2,
B Kreikemeyer3,
J Emmrich1
+ Автор связи

1
Отделение гастроэнтерологии, Отдел внутренней медицины, Университет Ростока, Росток, Германия
2
Кафедрой общей, торакальной, сосудистой хирургии и трансплантологии, Университет Ростока, Росток, Германия
3
Отдел медицинской микробиологии и гигиены больница, Институт медицинской микробиологии, вирусологии и гигиены, Университет Ростока, Росток, Германия
С Maletzki, Отделение гастроэнтерологии, Отдел внутренней медицины, Университет Ростока, Эрнст-Heydemann-Str. 6, D-18055 Rostock, Germany; Claudia.Maletzki @ Uni-rostock.de
Пересмотренная 28 сентября 2007
Принимаемые 6 ноября 2007
Опубликована первая онлайн 19 ноября 2007

Следующий раздел
Аннотация
Справочная информация: Это исследование имя потенциал бактериолитический терапии с использованием Streptococcus pyogenes В сингенных поджелудочной мышиной модели рака.

Методы: Panc02 опухоли либо были инфицированы S pyogenes или лечились эквивалентный объем транспортного средства. В дополнение к оценке опухоль гистологии и иммуногистохимии, изолированные спленоцитов были проанализированы с помощью проточной цитометрии. Интерферон (IFN) γ секреции как реакция спленоцитов против опухолевых клеток было показано, через технику ELISPOT. Цитотоксического эффекта лимфоцитов с целью опухоль была обнаружена лактатдегидрогеназы (ЛДГ) освобождение. Были измерены уровни цитокинов в сыворотке крови.

Результаты: Однократного применения живых бактерий в штатные опухолей Panc02 привели в полной регрессии опухоли. Это antitumoural эффектом сопровождалось массовым лейкоцитарной инфильтрации в опухоли, а также значительный и устойчивый высота системного уровня провоспалительных цитокинов IFNγ, опухоли α фактор некроза и интерлейкин-6. Лимфоцитов получены от мышей конкретно признали сингенных клеток опухоли в IFNγ-ELISPOT и, самое главное в клеточной цитотоксичности анализов, указывающие на опухоль-специфического иммунного ответа.

Выводы: Мы предоставляем данные, как прямые, так литической активности S pyogenes опухолевых клеток к инфекции и механических инфильтрация опухоли клетками иммунной системе приводят к повреждению клеток опухоли после распространения опухоли компоненты. Последний результат позволяет активации опухоли конкретного эффекторных клеток, скорее всего в осушение лимфатические узлы, способствует провоспалительных контексте. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что применение живой S pyogenes может быть перспективным новая стратегия лечения для продвинутых больных раком поджелудочной железы, которая требует дальнейшего изучения.

Предыдущий разделСледующий раздел
Цель иммунотерапии является стимуляция иммунной системы, чтобы восстановить свою способность распознавать и реагировать на остаточные опухолевые клетки, и это может быть полезным дополнением к обычной противоопухолевой стратегии.1 Иммунотерапия началась более 100 лет назад, когда Нью-Йорк хирург Уильям B Коули отметил, что злокачественные опухоли, в частности, саркома, регрессировал у пациентов, которые развитые одновременных бактериальная инфекция после хирургической резекции.2 Таким образом, прививки токсин Коули's, бактериальная вакцина Streptococcus pyogenes и Serratia marcescens, Стала краеугольным камнем в развитии иммунотерапии онкологических заболеваний. Пациенты, кто пережил болезнь инфекционные процессы, включая высокую температуру и озноб, а также испытали благотворное влияние на злокачественности и, наконец, вылечить их опухолей путем развития мощного иммунного ответа.2

Основываясь на этой первоначальной работы, исследователи разработали множество различных видов иммунотерапии, включая передачу иммунных клеток активных например, лимфокин-активированных клеток, применение моноклональных антител (МоАТ), активация специфических клеток эффекторных опухолью Сотовый лизатами или выдержки, а также активизация неспецифических эффекторных клеток (макрофагов, естественных киллеров (NK) клеток) микробных или химических адъюванты.1 Интересно, что закапывание жизнеспособной ослабленные микобактерии БЦЖ-конкретно-прежнему успешно используется в клиническом лечении поверхностного рака мочевого пузыря.3 Сегодня хорошо известно, что как прямое tumouricidal эффекты и активация иммунной системы посредников эти противоопухолевые деятельности бактерий или их компонентов.4--6 В последнее время некоторые группы разработали новые подходы с использованием antitumoural опухоль-терапевтических бактериальных штаммов. Yazawa и др. описали селективный потенциал роста анаэробных Bifidobacterium Longum в гипоксической регионов несколько видов твердых опухолей.7 8 Аналогичным образом, Фогельштейн и сотрудники разработали эффективную терапию antitumoural путем объединения внутривенного введения смертоносного токсин свободно споры Clostridium новый со стандартной химиотерапией.9 10 Совсем недавно, Чжао и др. создал ослабленный штамм Сальмонелла Typhimurium которые избирательно растет и убивает клетки опухоли простаты в обнаженная модель мыши.11

Учитывая мрачные прогнозы для больных с протоковой аденокарциномы поджелудочной железы,1 12 Роман иммунотерапевтическим возможностей вмешательства должны быть разработаны для лечения этой злокачественной.4 13--16 Streptococcus pyogenes является важным факультативно анаэробных патогенов, которые могут вызывать инфекции различной степени тяжести в организме человека, начиная от простых, не гнойных инфекций глотки и кожи к угрожающим жизни инвазивными инфекциями.17 В настоящей работе мы попытались решить вопрос о том, бактериолитический терапии с использованием S pyogenes применяется для лечения рака поджелудочной железы. Для достижения этой цели, мы проанализировали воздействие одного intratumoural инъекций S pyogenes на установленных мышиных опухолей поджелудочной железы в сингенных модель мыши. Это одно применение S pyogenes привели к полной регрессии опухоли в течение 4 недель. Массовые активации иммунных механизмов реагирования вторичными по отношению к инфекции сопровождаются регрессии и способствовали искоренению опухоли.

Таким образом, S pyogenes может быть отличным кандидатом для оценки активной противоопухолевой терапии. Эти результаты могут представлять особый интерес для клинических аддитивных лечении больных с опухолями поджелудочной железы.

Предыдущий разделСледующий раздел
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клеточные линии и мышей
Panc02 клеток (любезно предоставлены д-р Арно Шольц, Шарите-медицинский университет Берлина, Берлин, Германия) были первоначально созданы по Корбетт и его сотрудниками в 1984 году 3-МЕТИЛХОЛАНТРЕНОМ лечение pancreata женщин C57Bl / 6 мышей.18 EL4 клеток лимфомы и ректальной полиплоидных клетки карциномы CMT-93 были представлены American Type Culture Collection (Манассас, VA). Фибробластоподобных MC3T3-E1 клетки были приобретены у Deutsche Sammlung фон Mikroorganismen Und Zellkulturen (Брауншвейг, Германия). Все данные были сохранены в модифицированной среде Игла Дульбекко's (DMEM; Биочром AG, Берлин, Германия), с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ПАК, Кельбе, Германия) и 1% пенициллина / стрептомицина (Инвитроген, Карлсруэ, Германия), и инкубировали при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% CO2. Женские 8-10-недельного возраста мыши C57Bl/6N были приобретены у Charles River вкл. (Зульцфельд, Германия). Животные подвергались воздействию циклы 12 ч light/12 ч темноты и получили стандартный продовольствием и водой неограниченное объявлений. По утверждению местных комитетов по благосостоянию животных, эксперименты проводились в соответствии с немецким законодательством о защите животных, а также "Руководство по уходу и использованию лабораторных животных".

Бактериальный штамм, условия и культура
Одну группу стрептококковой изолировать, S pyogenes серотип М49 (штамм 591), культивируют в Тодда-Хьюитт (TH) бульоне или на TH агар (Oxoid Unipath, Везель, Германия), и дополнить с 0,5% дрожжевого экстракта (THY), была использована в данном исследовании. Для intratumoural инфекции, S pyogenes был выращен в бульоне TH ночь до середины журнала фазу и доводили до концентрации около 1 × 106 Колония-единиц (КОЕ) / мл на основе оптического считывания плотность при 600 нм и на обшивке анализа.

Животный опухоль модели и применение бактериальных
Краткое под наркозом эфира, у мышей-самок C57Bl/6N вводили подкожно в правую заднюю фланге с 1 × 106 Panc02 клеток. Объем перерастает опухолей были оценены в соответствии со следующей формулой: ширина2× длина × 0,52.9 Когда опухоль достигла размеров около 60 мм3, Около 9-12 дней после инокуляции опухоли клетки, одна группа была заражена intratumourally с 1 × 106 КОЕ / мл S pyogenes (50 мкл том, растворенных в фосфатно-буферном растворе (PBS), N = 28). Животные, которые получили эквивалентные объемы растворителя один служил в качестве транспортного средства обращению управления (транспортное средство, N = 6). Группа без intratumoural инъекций служила опухоль несущих контроля (опухоли, N = 6). Дополнительные группы опухолей, свободных животным относиться с 1 × 106 КОЕ / мл S pyogenes внутрикожно в правую заднюю фланга (М49-C, N = 6). Физиологическое значение контроля были получены от животных без какого-либо вмешательства (контроль, N = 3). Мышей пожертвовала 7, 14, 21 и 28 дней после бактериальная инфекция, или когда они стали умирающий перед опухоль объем достиг 1500 мм3. В конце каждого эксперимента образцы крови, опухоли, селезенку и лимфатические узлы брыжейки были удалены от животных всех групп для дальнейшего анализа. Чтобы оценить частоту системной распространения S pyogenes, Образцы крови у всех зараженных животных были приняты в заданных точках времени (день 7, 14, 21 и 28) и при посеве на овец кровяной агар.

Rechallenge эксперимент
Через четыре недели после иммунотерапии S pyogenes, Успешно лечил и М49-С животными (каждый N = 6), полученные tumourigenic доза Panc02 опухолевые клетки (1 × 106) Во фланг, на контралатеральной стороне первого применения опухоли. Опухоль объемы были измерены два раза в неделю, как описано выше, за 4 недели до euthanised животных.

Апоптоз анализа
Для обнаружения апоптоз, клетки и впоследствии trypsinised лизированной. Количественной оценки активности каспазы 3, Б. Д. ApoAlert каспазы пробирного пластинка была использована в соответствии с инструкциями изготовителя (BD Biosciences, Гейдельберг, Германия). Каспазы 3 активность определяли флуорометрического обнаружения на Cytofluor 2300 (Millipore, Schwalbach, Германия, EX / EM: 380/460 нм).19 Кроме того, апоптоз была количественно с помощью проточной цитометрии суб-G1 анализа пиков как описано выше.20

Гистологии и иммуногистохимия
Лейкоциты в резекции опухоли тканей, окрашенных по CAE (хлорацетат эстераза) техники. Количества лейкоцитов / мм2 были определены в ослепила рассчитывает положительной окраски и морфологии в 50 последовательных полях высокой мощности (HPFS). Для подтверждения лейкоцитарной инфильтрации опухоли в массе, срезах ткани инкубировали с анти-коза мыши CD4 (1:100, Санта-Крус биотехнологии, Гейдельберг, Германия), крысы против мыши CD8 (1:200, Санта-Крус биотехнологии) и кроликов анти-CD88 мыши (1:200, Санта-Крус) антител в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем щелочной фосфатазы, конъюгированных антителами мыши (Санта-Крус). Сайты фосфатазы обязательными были обнаружены помощью фуксин как хромоген. Counterstained срезов гематоксилин и изучены с помощью световой микроскопии (Axioskop 40, Zeiss, Оберкохен, Германия).

Проточная цитометрия
СПЛЕНОЦИТАХ были выделены в различные моменты времени от инфицированных и неинфицированных животные помощью Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, Упсала, Швеция) Градиент центрифугирования. Впоследствии клетки были названы следующие изотиоцианата флуоресцеина (FITC) конъюгированных крысы против мыши МКАТ: CD4, CD8, CD11b, Gr1, CD62L (1:20, Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия), CD25 и CD71 (1 : 20, BD Pharmingen). Образцы анализировались на FACSCalibur цитометра (BD Pharmingen) с помощью программного обеспечения CellQuest.

ELISPOT анализа интерферона γ-секретирующие лимфоциты
Интерферон γ (IFNγ) конкретные МАБ (Mabtech, Гамбург, Германия) с покрытием, 96-а microtitre пластины были заполнены с 1 × 104 клетки-мишени / а (Panc02, EL4, CMT-93, MC3T3-E1 и мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs)) и инкубировали в течение 2 ч. СПЛЕНОЦИТАХ (105) Была предоставлена на цели и совместное культурное одночасье. Наконец, антитело было визуализировать на 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат / Nitro Blue тетразолия (BCIP / НБТ; KPL, Gaithersburg, MD) и пятна насчитывалось помощью вскрытия микроскоп (Zeiss, Оберкохен, Германия) . Представлены числа IFNγ секретирующих клеток на 105 эффекторных клеток с поправкой на фоновом уровне учитывается в отсутствие клетки-мишени, которая обычно составляет от 10 до 20 spots/105 клеток. Клетки-мишени без эффекторных клеток показали не фонового уровня.

Лактатдегидрогеназа цитотоксический
Колориметрический CytoTox одной однородной мембраны Integrity Assay (Promega, Мэдисон, Висконсин) был использован оценке лактатдегидрогеназы (ЛДГ) освобождение от лизис клеток. Опыты проводились в соответствии с протоколом производителя. Литической активности лимфоцитов из мезентериальных лимфатических узлов против клеток-мишеней (Panc02, EL4, CMT-93, MC3T3-E1 и PBMCs) была измерена ночь после инкубации при Effector: клетки-мишени отношением 30:1. Максимальный ЛДГ освобождении была достигнута при инкубации клеток-мишеней с помощью прилагаемого лизис буфера. Клетки-мишени без эффекторных клеток, были использованы в качестве негативного контроля. Флуоресценции, измеренных на Cytofluor 2300 (Millipore, EX / EM: 530/620 нм). Цитотоксичность рассчитывается по следующей формуле:% цитотоксичность = 100 × (экспериментальный релиз - спонтанное освобождение эффекторных клеток - спонтанное освобождение клеток-мишеней) / (максимальный ЛДГ релиз - спонтанно-релиз (негативный контроль) клеток-мишеней).21 22

Bio-Plex Белки Array система
Группа цитокинов сыворотки крови измерялся в двух экземплярах помощью Bio-Plex Белки Array системы (BioRad, Мюнхен, Германия), в соответствии с инструкциями производителя. С Bio-Plex цитокинов комплекта анализа в сочетании с Bio-Plex Manager, сыворотка IFNγ, фактора некроза опухоли α (TNFα), интерлейкин (IL) 3, IL5, IL6, гранулоциты-макрофаг колонии-стимулирующий фактор (GM-CSF ) и колоний гранулоцитов стимулирующего фактора (Г-КСФ) оцениваются на протяжении всего времени ходе инфекции. Значения соответствующие уровни цитокинов сыворотки необработанной контрольных мышей набор 1, а все остальные данные, переданные в виде X-кратное увеличение.

Статистика
Все значения выражаются в виде среднего (SEM). Поскольку ни одно существенное различие было измерено в любом из оценки параметров между транспортным средством обращению животных и опухоль-переноски и М49-инфицированных опухолей, свободных мыши в различные моменты времени, данные только из одной временной точке (день 28, N = 6) были приняты для графического представления и статистическая оценка. Данные из необработанных контрольных животных (N = 3) служит физиологической ценности и отображаемые в графиках, однако они не были рассмотрены для статистического анализа между группами. Аналогичным образом, опухоль, свободные S pyogenes-инфицированные животные служили только в качестве внутреннего контроля за бактериальной инфекции. Оказавшись предположения о нормальности и равной дисперсии, сравнений между группами были проведены с использованием дисперсионного анализа (ANOVA), а затем соответствующий постфактум сравнения теста (SigmaStat, Jandel корпорации "Сан-Рафаэль, Калифорния). Критерий значимости принимался равным р <0,05.

Предыдущий разделСледующий раздел
РЕЗУЛЬТАТЫ
Выбор бактериального штамма и дозы инфекции
Во-первых, мы исследовали влияние различных S pyogenes Нагрузка на Panc02 клеток поджелудочной железы рак IN VITRO (кратность инфекции (МВД) = 25)). Большинство штаммов не посредниками значительное торможение роста или убийство деятельности. Однако активности каспазы 3 испытания и суб-G1 пике анализ показал, что S pyogenes серотип М49 штаммом 591 оказывали серьезное цитотоксических реактивность, что наиболее вероятно, связано с индукцией апоптоза клеток поджелудочной железы к раком мышиной (Panc02) и человеческого (Panc1, BxPC3, Capan2) происхождения (Рис 1 и данные не представлены). Следовательно, S pyogenes серотип М49 штаммом 591 был выбран для оценки бактериолитический antitumoural терапии в VIVO. Бактерии были применены intratumourally максимизировать местных antitumoural воздействия и минимизации возможных системных цитотоксичность.


Просмотр увеличенной версии:
В новом окне
Скачать как слайдов PowerPoint
Рисунок 1 Количественный анализ апоптоза. (А) увеличение активности каспазы 3 в Panc02 клеток после заражения S pyogenes М49 дикого типа (WT), ориентировочный для индукции апоптоза, что было подтверждено (B) цитофлуориметрического суб-G1 анализ пика. Клеток с содержанием ДНК ниже G1 пике считались апоптозу. Результаты показывают данные из трех отдельных экспериментах. (C) Panc02 клетки показывают характерное суб-G1 пики на 4 ч постинфекционные (представительных результатов из трех независимых экспериментов). Средние (СЭМ); * P <0,05 по сравнению с контролем; ** P <0,001 по сравнению с контролем, рассчитанная на основе анализа дисперсий.
Далее, мы стремились оценить оптимальное терапевтическое, нетоксичны числа инфекций. Увеличивается количество бактерий вводили (105, 106 и 107 КОЕ / мл). Животные группой, получавшей высокие дозы бактериальных стремительно развились серьезные признаки системной инфекции и умер (Рис 2). В противоположность этому, только два животных (15%) умерли от администрации S pyogenes в среднем (106 КОЕ / мл) и низким (105 КОЕ / мл) бактериальной дозах, соответственно, еще 4 недели постинфекционные. Для IN VIVO применения, высокая допустимая доза была выбрана (106 КОЕ / мл).


Просмотр увеличенной версии:
В новом окне
Скачать как слайдов PowerPoint
Рисунок 2 Кривая выживаемости мышей с C57Bl/6N гетеротопической сингенных поджелудочной железы. После создания опухоли мыши получали одну инъекцию intratumoural S pyogenes и контролировалась в течение 28 дней с соблюдением этических требований. Для оценки оптимальных терапевтических дозах, бактерии вводились в трех различных дозах. Эксперимент как минимум пять мыши на каждую группу.
Валовая выводов после заражения S pyogenes
Intratumoural администрация S pyogenes не влияет на рост рак поджелудочной железы в течение первых 4 дней. Ощутимыми опухоли продолжали расти и достигли среднего размера 128,6 (11,8) мм3), Которая была сопоставима с размерами опухоли транспортного средства обращению животные (151,9 (11,8) мм3). Затем, примерно 6-8 дней после заражения, опухолей в группе инфекций заметно и количественно меньше, чем у контрольной группы (р <0,05 по сравнению с контролем и транспортных средств; Рис 3) И нередко язвенная и, видимо, necrotised 10-14 дней после инфицирования (Рис 3). Это в конце концов привели к почти полной регрессии в течение 4 недель.


Просмотр увеличенной версии:
В новом окне
Скачать как слайдов PowerPoint
Рисунок 3 Кинетики роста опухолей у животных на 7, 14, 21 и 28 дней после intratumoural бактериальные инфекции и после rechallenge. Животные получали tumourigenic доза Panc02 клеток. Naïve М49-C животные были использованы в качестве контроля. Мыши, которые произошли бактериолитический терапии были частично защищены от повторного воздействия Panc02 клеток. Средние (СЭМ); * P <0,05 против опухоли; † Р <0,05 против транспортного средства; § р <0,05 против М49-C rechallenge, рассчитанная на основе анализа дисперсий.
Проанализировать частоту системной распространения S pyogenesМы никелированная образцы крови у всех зараженных животных на данный момент точек на овец кровяной агар, выявление системных бактериальные инфекции у 2 из 28 несущих опухоли мышей и ни в одном из 12 опухолей, свободных, животные М49 контроля. Два системных инфицированными животными отображается отсутствие аппетита, потеря веса и атаксии. Из-за тяжести инфекции, эти животные были euthanised и сопутствующих данных исключена.

После периода наблюдения (1, 2, 3 и 4 недели), были принесены в жертву животных. Макроскопическое исследование органов показали никаких побочных эффектов, таких как некроз или кровоизлияние, но не было массовых спленомегалия лишь в несущих опухоли мышей, которые подверглись бактериолитический терапии (примерно семь-восемь раз для увеличения размера на всех временных точках, данные не представлены). Интересно, селезенке опухолей, свободных мышей, инфицированных S pyogenes Макроскопически не были увеличены.

Аналогичным образом, в день 14 постинфекционные, животных в группе лечения исключительно выставлены переходных лейкоцитов (р <0,05 по сравнению с контролем и транспортных группах, соответственно), а также устойчивым падением уровня гематокрита (р <0,05 по сравнению с контролем, и транспортное средство) (Таблица 1). Устойчивый низкого уровня гематокрита отрицательно коррелировала с размерами селезенки.23 В этом случае, снижение гематокрита может свидетельствовать о расширении объемов лейкозом.

Просмотр этой таблице:
В этом окне
В новом окне
Таблица 1 Системный анализ крови клеток и гематокрита в контрольных группах (контроль, М49-C, опухоли, транспортного средства) и 7, 14, 21 и 28 дней после S pyogenes инфекция
Опухоль rechallenge демонстрирует лишь частичную защиту
Чтобы проверить, в какой степени бактериолитический терапия привела не только к регрессии опухоли, а также индуцированные защитные иммунологические к памяти повторного воздействия Panc02 клеток опухоли, был проведен эксперимент rechallenge опухоли. Группа состояла из животных, опухоли, свободных после лечения и наивно М49-C мышей. Оба получили tumourigenic доза Panc02 клеток в противоположном фланге. Через четыре недели после инокуляции опухоли, М49-C мыши отображается растущие опухоли (889,5 (245,7) мм3) (Рис 3). В rechallenge группе, развитие опухолей был значительно задержан (226,6 (71,3) мм3, Р <0,05) (Рис 3), С одного животного оставшиеся опухоль бесплатно до конца эксперимента. Взятые вместе, это означает, что терапия с использованием бактериолитический М49 мощным связующим звеном antitumoural реактивности VIVO. Однако только один из шести животных был полностью защищен от повторного контакта с Panc02 опухолевых клеток.

Проникновение лейкоцитов в опухоли следующие intratumoural инъекций S pyogenes
Чтобы оценить степень лейкоцитарной инфильтрации в качестве меры реагирования местных antitumoural после заражения S pyogenes, Опухолевые ткани были впервые изучены гистологии CAE (Рис 4). Эти эксперименты показали, в соответствии с системными лейкоцитоз, положительная окраска отдельных лейкоцитов, с наивысшими значениями на 7 дней и 14 после бактериальные инфекции (р <0,05 по сравнению с контролем и транспортных средств, Рис 4C), Но значения остаются по меньшей мере в три раза выше, чем у контрольных животных.


Просмотр увеличенной версии:
В новом окне
Скачать как слайдов PowerPoint
Рисунок 4 Представитель изображений лейкоцитарной инфильтрацией тканей поджелудочной транспортного средства после лечения (А) или в день 7 (б) после S pyogenes инфекции. (C) Количественный анализ хлорацетат эстераза (CAE)-положительных лейкоциты проникают в ткани опухоли. Данные из контрольной группы являются репрезентативными для других точек времени (Original увеличение, × 40). Средние (СЭМ); * P <0,05 против опухоли; † Р <0,05 против транспортного средства, рассчитанные на основе анализа дисперсий.
Как показано в Рис 5, Большинство из этих проникающих клетки гранулоцитов (CD88-положительных) и CD4+ Т-клетки, в то время цитотоксических Т-клеток (CD8-положительных) оказались заметно в некротической регионов опухоли (Рис 5). Кроме того, воспалительными клетками были обнаружены лишь в редких случаях в контроле опухоли, и среди них не было CD4+ или CD8+ Т-клеток и CD88+ гранулоцитов.


Просмотр увеличенной версии:
В новом окне
Скачать как слайдов PowerPoint
Рисунок 5 Представитель изображений CD4, CD8 и CD88 иммуногистохимическое окрашивание тканей опухоли поджелудочной железы после транспортное средство лечения (A, D, G) или в день 7 (B, E, H) и День 21 (C, F, I), после S pyogenes инфекции (106 КОЕ / мл, n = 7 в момент времени). Обратите внимание на массовое накопление CD4-положительные Т-хелперов и гранулоцитов в рамках бактериально инфицированной опухолевой ткани (в оригинале увеличение, × 40).
Определение спленоцитов подмножеств цитофлуориметрического анализ
Далее, мы проанализировали состав иммунных клеток селезенки (Таблица 2). Мы наблюдали высота макрофаги и моноциты (CD11b+), А также пожилые гранулоцитов (Gr1+) В течение первых 2 недель после заражения (Таблица 2). Количество трансферрин рецептор-позитивные (CD71) клетки были существенно подняты, тогда как выражение L-селектин (CD62L) постепенно downregulated. Уровень CD4+ (Т-хелперы), CD8+ (цитотоксические) и CD25+ Т-клеток были слегка повышенной в течение первых 3 недель постинфекционные (Таблица 2). Тем не менее, резкое снижение числа CD4+ а также CD8+ Т-клеток в день 28 отражено возможности миграции иммунологических эффекторных клеток больше в лимфоидной ткани, чем в селезенке.

Просмотр этой таблице:
В этом окне
В новом окне
Таблица 2 Анализ спленоцитов подмножества в контрольных группах (контроль, М49-C, опухоли, транспортного средства) и 7, 14, 21 и 28 дней после S pyogenes инфекции (%)
Изменения уровня цитокинов в результате инфекции
Данные, описанные выше указанных воспалительные реакции в тканях опухоли М49 обращению животных. Таким образом, мы интересуется, может ли системный эффект может быть измерена в дополнение к этим местным явлением. Сывороточные уровни цитокинов были определены от инфицированных и не инфицированных животных. Анализ хемотаксис нейтрофилов полипептидных Г-КСФ показали 158,5 (33,8) и 21,1 (4,6) увеличения на 3 дня и 7, соответственно, после S pyogenes лечения по сравнению с контрольными значениями (р <0,001, Рис 6). Кроме того, мы обнаружили значительное увеличение для IFNγ и IL3 на 7 дней, с возвращением в ближайшее-физиологических значений всех трех Th1 цитокинов в более поздние моменты времени (Таблица 3), Что свидетельствует о сильном провоспалительных стимулов, особенно в ранних стадиях S pyogenes инфекции. Аналогичная картина была видна TNFα (Таблица 3). На 14 день, S pyogenes инфекция, возникающая в пять раз увеличить IL5 и 15-кратное увеличение IL6, а затем троекратное увеличение ГМ-КСФ уровнях на 21 дня (Таблица 3).


Просмотр увеличенной версии:
В новом окне
Скачать как слайдов PowerPoint
Рисунок 6 Кинетика цитокинов колоний гранулоцитов стимулирующего фактора (Г-КСФ) в ходе экспериментального ход времени. Животные, которые были инфицированы intratumourally с S pyogenes показали огромное увеличение Г-КСФ на 3-й день после лечения, в то время никаких существенных различий были измерены в контрольных животных. Результаты показывают данные из трех мышей в момент времени. Средние (СЭМ); * P <0,05 против опухоли; † Р <0,05 против транспортного средства, рассчитанные на основе анализа дисперсий.
Просмотр этой таблице:
В этом окне
В новом окне
Таблица 3 Сыворотка цитокинов деятельности в контрольных группах (контроль, М49-C, опухоли, транспортного средства) и 7, 14, 21 и 28 дней после S pyogenes инфекция
Лимфоциты инфицированных животных конкретно признать опухолевых клеток
Далее мы рассмотрели ли иммунных клеток реагировать на раздражение от опухолевых клеток. Во-первых, реакция сотрудничество спленоцитов-инкубировали ночь с различной целевой популяции клеток была измерена в IFNγ-ELISPOT анализов. Panc02 клеток опухоли вызвало IFNγ релиз исключительно в спленоцитов получены от М49 обращению животных. Однако эта реакция была статистически значимы только в день 14 постинфекционные (р <0,05 по сравнению с контролем и транспортных средств; Рис 7A). Интересно, что аналогичные результаты были получены с другими сингенных опухоли клеточных линий, таких как линия лимфома EL4 клетки и клетки колоректальный рак CMT-93 (Рис 7A). Далее мы определяли активность спленоцитов животных, не являющихся раковые клеточные линии контроля, чтобы исключить неспецифическую реакцию. Что касается IFNγ релиза, ни одна из лейкоцитов показал реактивностью против сингенных MC3T3-E1 фибробласты или PBMCs (Рис 7B).


Просмотр увеличенной версии:
В новом окне
Скачать как слайдов PowerPoint
Рисунок 7 Количественный анализ интерферона (IFN) γ-ELISPOT анализа. Реактивность спленоцитов против опухоли целью была испытана после совместной инкубации в течение ночи при Effector: клетки-мишени отношением 30:1. СПЛЕНОЦИТАХ от инфицированных животных на 7, 14, 21 и 28 дней после intratumoural бактериальные инфекции показали значительно более высокую реактивность против клеток-мишеней, чем те, от контрольных животных (28 день). Данные из контрольной группы являются репрезентативными для других точек времени. Удивительно, что реакционная спленоцитов против Panc02, EL4 и CMT-93 клеток (A) сократился с 7 дней до 28 после заражения. Кроме того, лимфоциты показал не реакционный против MC3T3-E1 фибробласты или мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) (B) во время периода инфекции, подчеркивая опухолевую клетку конкретной деятельности. Результаты показывают данные из трех отдельных экспериментах. Средние (СЭМ); * P <0,05 против опухоли; † Р <0,05 против транспортного средства, рассчитанные на основе анализа дисперсий.
В более функциональных анализов цитотоксичность, мы использовали лимфоциты получены из лимфатических узлов эффекторных клеток. Опять же, лимфоциты S pyogenes-мышей признана Panc02 опухолевые клетки, лимфоциты, но из-под контроля животных не показывают литической активности. Следует отметить, что убийство активность лимфоцитов от опухоли-инфицированных постоянно увеличивается группа постинфекционные (р <0,05 по сравнению с контролем и транспортных средств; Рис 8A). Кроме того, другие сингенных клеточных линиях опухоли (EL4 и CMT-93) было также эффективно лизировали (Рис 8A). Опухоль специфики могут быть подтверждены отсутствует или маргинальных цитотоксичности против не раковые клетки контроля (MC3T3-E1 и PBMCs) (Рис 8B). Таким образом, признание опухолевых клеток в предыдущих экспериментах, и предлагаются конкретные индукции специфического иммунного ответа, что способствует наблюдается регресс опухоли S pyogenes-инфицированными животными.


Просмотр увеличенной версии:
В новом окне
Скачать как слайдов PowerPoint
Рисунок 8 Количественный анализ цитотоксичности помощью лактатдегидрогеназы анализа освобождении. Лимфоциты были изолированы от брыжеечных лимфатических узлов и сотрудничества с культурными целями в течение 24 ч при Effector: клетки-мишени отношением 30:1. Лимфоциты от инфицированных животных на 7, 14, 21 и 28 дней после intratumoural бактериальные инфекции показали значительно более высокой литической активности против клеток-мишеней, чем те, от контрольных животных (28 день). Цитотоксичности лимфоцитов против (А) Panc02, EL4 и CMT-93 клеток увеличилось с 7 дней до 28 после инфицирования, до> 50%. В отличие от этого, не литической активности лимфоцитов против (б) не раковая MC3T3-E1 был замечен клеток или мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs). Данные из контрольной группы являются репрезентативными для других точек времени. Результаты показывают данные из трех отдельных экспериментах. Средние (СЭМ); * P <0,05 против опухоли; † Р <0,05 против транспортного средства, рассчитанные на основе анализа дисперсий.
Предыдущий разделСледующий раздел
ОБСУЖДЕНИЕ
Учитывая неблагоприятный прогноз пациентов с поздними стадиями рака поджелудочной железы и неудовлетворительным результатам стандартных терапевтических вмешательств, развиваются новые стратегии лечения является императивом. Таким образом, мы изучили antitumoural потенциал бактериолитический терапии, основанной на факультативных анаэробных бактерий. Мы выбрали S pyogenes в качестве модели бактериальный штамм, потому что это может оказать прямое воздействие на цитолитический эукариотических клеток,24 25 опосредованная различными цитотоксических ферментов и порообразующих токсинов.26 27 Среди них haemolysins стрептолизин S и стрептолизином О, кажется, играют ключевую роль.25 28 29 В ходе предварительных расследований в VITRO, мы обнаружили, что S pyogenes Действительно посредничает поджелудочной серьезные повреждения клеток карциномы (неопубликованные данные). Другая причина для использования S pyogenes является исключительная чувствительность стрептококков к пенициллину, который позволяет легко искоренение следующих терапевтического применения.17 В качестве модели поджелудочной железы, мы избрали агрессивно растет, плохо иммуногенной модель мыши Panc02.18 Эти опухоли показать внутреннюю нечувствительность к противоопухолевых агентов.18 30--32

Есть важных и актуальных особенностей, общих для инфицирования S pyogenes у мышей и человека инфекции: (1) быстрое повреждение клеток после инфицирования, сопровождается изъязвления и некроз тканей зараженных; (2) значительный и устойчивый высота провоспалительных цитокинов (TNFα, IFNγ) и хемокинов (Г-КСФ), (3 ) высокий приток воспалительными клетками иммунной системы (например, нейтрофилы, макрофаги и ЕК-клетки) в фокус-инфекции; и (4) активизация адаптивных, клеточный иммунный ответ.16 33--35 Кроме того, внутривенное введение живых бактерий вызывает сильную токсичность.25 36 Учитывая эти факты и ранее упомянутые требования для прямого бактериальных и опухолевой клетки контакт, мы сосредоточились на местном, intratumoural инъекции, а не на системные приложения.

Заметным результатом нынешних экспериментов было полной регрессии опухоли в течение 4 недель после intratumoural Администрации жить S pyogenes. Это antitumoural эффекта предлагает активное участие в руке врожденной иммунной системы. В поддержку этого толкования, было установлено, что в ходе начального этапа S pyogenes инфекции, врожденных иммунных клеток, то есть, гранулоциты, моноциты-макрофаги, и являются основными эффекторы ответивших на работу в месте инфекции.9 28 33 34 Наши наблюдения решительно выступает за текущий воспалительный ответ: Эти замечания относятся гранулоциты (CD88-положительных), которые массово проникнуть инфицированы опухолей; значительное увеличение селезенки гранулоцитов и моноцитов и макрофагов (CD11b-положительных), а также системные производство провоспалительных цитокинов, таких как IL3, IFNγ и TNFα. Основная цель этого воспалительного ответа является предотвращение системного распространения бактерий,9 главным образом весьма эффективными фагоцитарную активность мышиных макрофагов, которые особенно способным убить стрептококков.28 36

IN VITRO функционального анализа показали, что специфического иммунного ответа в условиях IFNγ релиз был ограничен иммунных клеток, полученных от бактерий М49-лечение опухолевых животных. Этот вывод дополнительно поддерживается потенциальных лимфоцитов к клеткам признать Panc02 в цитотоксичности. Опухоль была специфика далее подчеркнули, из-за отсутствия реактивности к не-раковые клетки контроля. Интересно отметить, что мы также наблюдается перекрестных реакций этих клеток лимфоцитов с другими лицами сингенных опухоль, возможно, объясняется наличием общих лимфоцитов признании опухолевых антигенов.

Чтобы объяснить нашим данным, мы предлагаем следующую модель. Intratumourally ведении S pyogenes вызывать инфильтрацию воспалительных клеток из периферической крови в зараженных тканях,29 37 где они занимают инфицированные клетки, чтобы очистить бактериальной инфекции. В крылом лимфатические узлы, компоненты клеточной мусора представлены другие иммунные клетки. В результате продолжающегося воспаления и активированного статус представляющие клетки, специфические иммунные реакции легко может быть возбуждено. Вполне возможно, что в этом контексте, опухоль-специфической иммунной реакции также срабатывает.37 Следовательно, животные, по крайней мере частично защищена от опухоли rechallenge. Однако частичный характер этого защитного иммунитета дальнейшие намеки на необходимость сильного воспалительного стимулов к искоренению опухоли бремя полностью.

Насколько нам известно, мы являемся первыми, чтобы показать, что S pyogenes Первоначально инфекция активизирует иммунную систему и приводит к генерации опухоли конкретного эффекторных клеток, способствуя регрессии поджелудочной железы. Это предположение подкрепляется выводами других групп, которые использовали инактивированный S pyogenes подготовка (ОК-432) для лечения некоторых типов экспериментальных опухолей. Полезность ОК-432 в VIVO созревание дендритных клеток, приводя к индукции устные опухоли конкретного цитотоксических Т-лимфоцитов в сочетании с применением химиотерапевтических агентов не было продемонстрировано.38 Кроме того, Ono и др. доказали полезность ОК-432 как вспомогательное вакцинации в сочетании с опухолью конкретного эпитопом Т-клеток.39 Вопреки нашим выводам с помощью одного intratumoural инъекции живых бактерий, экспериментальные опухоли бывшего исследования не полностью регресс после терапии. Впечатляющие опухоль ставок искоренение аналогичных тем, которые наблюдались нами были, однако, сообщили Avogadri и др. использование ослабленных Сальмонелла.37 Интересно, что высокая реакционная antitumoural строго зависит от расширенный репертуар Сальмонеллаконкретные Т-клетки проделанной prevaccination протокола.

Взятые вместе, мы показали, что иммунотерапия бактериолитический помощью факультативных анаэробных бактерий, таких как S pyogenes является перспективной новой стратегии для лечения поздних стадий рака поджелудочной железы, которая требует дальнейшего изучения.

Предыдущий разделСледующий раздел
Благодарности
Мы благодарим д-р Крюгер B для обеспечения доступа к Cytofluor 2300.

http://gut.bmj.com/content/57/4/483.full